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包含工程化嵌合抗原受体和CAR调节剂的组合物和方法与流程 　　
包含工程化嵌合抗原受体和car调节剂的组合物和方法发明领域1.本发明涉及病毒载体组合物、其转导细胞的用途以及通过此类方法制备的细胞组合物。2.发明背景3.肿瘤异质性描述观察到不同的肿瘤细胞可以表现出不同的形态学和表型特征，包括细胞形态、基因表达、代谢、运动性、增殖和转移潜能。4.异质性发生在患者之间、肿瘤之间(肿瘤间异质性)和肿瘤内(肿瘤内异质性)。肿瘤细胞之间观察到多种类型的异质性，来源于遗传变异性和非遗传变异性两者。5.由于肿瘤微环境的异质性，肿瘤细胞间的异质性可以进一步增加。肿瘤中的区域差异(例如氧的可用性)对肿瘤细胞施加了不同的选择压力，导致肿瘤不同空间区域中更广泛的优势亚克隆。微环境对克隆优势的影响也是许多患者中所见的原发肿瘤和转移肿瘤之间异质性以及同一肿瘤类型患者之间观察到的肿瘤间异质性的可能的原因。6.癌细胞的异质性给设计有效的治疗策略带来了重大挑战。7.例如，在不同的克隆群体间，异质性肿瘤可以展现出对细胞毒性药物的不同的敏感性。这归因于可能抑制或改变治疗效果的克隆相互作用。8.在异质性肿瘤中药物施用很少能杀伤所有肿瘤细胞。最初的异质性肿瘤群体可能会出现瓶颈，以至于很少有药物抗性细胞(如果有的话)会存活。这允许抗性肿瘤群体通过分支进化机制复制和生长新的肿瘤(见上文)。所得的再增殖肿瘤(repopulated tumour)是异质性的，且对最初使用的药物疗法有抗性。再增殖肿瘤也可以以更具侵略性的方式复发。9.嵌合抗原受体(car)10.嵌合抗原受体是将例如单克隆抗体(mab)的特异性移植到t细胞效应功能的蛋白质。其通常形式为i型跨膜结构域蛋白，具有识别抗原的氨基末端、间隔区、跨膜结构域，所有这些都连接到传递t细胞存活和激活信号的复合胞内域(见图1a)。11.这些分子最常见的形式是单链可变片段(scfv)的融合体，单链可变片段源自识别靶抗原的单克隆抗体，其经由间隔区和跨膜结构域融合到信号传导胞内域。此类分子导致t细胞的激活，以响应scfv对其靶标的识别。当t细胞表达此类car时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。目前已经开发了几种针对抗肿瘤相关抗原的car，而利用此类表达car的t细胞的过继转移方法目前正用于治疗各种癌症的临床试验中。12.成功的car治疗取决于肿瘤细胞的靶抗原的表达。在异质性肿瘤中，特别是实体癌中，抗原表达是异质性的，且不可能找到所有癌细胞都表达的单一靶抗原。13.此外，来自b细胞恶性肿瘤的car‑t细胞试验的新数据表明，对这类疗法的抗性的一个常见机制是出现靶抗原丢失或下调的肿瘤。抗原丢失或抗原低逃逸有可能成为在实体瘤中成功的更大障碍，所述实体瘤在靶抗原表达方面表现出更大的异质性。克服这一挑战的潜在方法包括工程化car t细胞以实现多种特异性，并对低水平的靶抗原做出应答，以及更有效地诱导car诱导的炎症所产生的自然抗肿瘤免疫应答。14.car t细胞的临床研究已确立，car t细胞的植入、扩增和持久性是临床活性，特别是持续应答的先决条件。体内car‑t细胞，特别是用于治疗实体癌的car‑t细胞持久性差的一个关键原因是这些细胞难以克服肿瘤的不利微环境。具体而言，car‑t细胞可能无法在实体肿瘤床内移植和扩增。15.car t细胞的持久性和活性可以通过施用细胞因子或通过工程化car t细胞以分泌或表达细胞因子、毒素或其它因子来增强。然而，这些方法都有局限性：系统性施用细胞因子可能是有毒的；组成型产生细胞因子可能导致不受控制的增殖和转化。16.因此，需要替代的car治疗方法来解决car‑t细胞疗法中通常遇到的问题，特别是考虑到患者之间以及同一患者内的肿瘤细胞之间和肿瘤细胞位点之间的异质性。附图说明17.图1‑显示经典嵌合抗原受体的示意图18.(a)嵌合抗原受体的基本模式；(b)第一代受体；(c)第二代受体；(d)第三代受体。19.图2‑说明体内a)t细胞活化和b)t细胞抑制的机制的示意图。20.图3‑说明jak‑stat信号传导通路(通过α‑干扰素激活)的示意图。21.图4‑嵌合抗原受体的不同结合结构域形式22.(a)fab car形式；(b)dab car形式；(c)scfv car形式。23.图5‑说明通过用共表达两种基因的单一载体(a)；和两种载体的混合物(其中每种载体表达单一基因)(b)转导获得的转导细胞组合物的差异的示意图。当用具有双顺反子盒的单一载体转导细胞时，每一个成功转导的细胞将以大约1:1的化学计量学表达两种转基因(a)。然而，当用多种载体转导细胞时，获得了更加异质化的群体：转导细胞可以表达单独的第一转基因，单独的第二转基因，或者两种转基因。在表达两种转基因的细胞中，基因a和基因b的相对表达水平是完全可变的(b)。24.图6‑散点图，其显示当t细胞用载体(a和b)的混合物转导时，一部分细胞未经转导；一部分细胞用单独的载体a转导；一部分细胞用单独的载体b转导；且一部分细胞用载体a和b转导。在本研究中，用载体的混合物转导细胞，所述载体之一表达抗cd19 car且所述载体之一表达cd22 car。25.图7–说明由实施例3中描述的双重载体组合物中使用的载体表达的分子的示意图。载体1表达具有与gd2结合的抗原结合结构域的car(gd2 car)，组成型活性细胞因子受体(ccr)，和分选(sort)/自杀基因(rqr8)。载体2表达相同的gd2 car，显性负性shp‑2(δshp2)；显性负性转化生长因子(tgf)βii受体(δtgfbrii)，和相同的分选/自杀基因(rqr8)。26.图8‑研究单一和双重转导的t细胞群杀伤表达gd2(supt1 gd2)的靶细胞和非表达(supt1 nt)靶细胞的能力。27.图9‑研究在没有进一步抗原刺激的情况下，在无细胞因子的完全细胞培养基中培养7天后，单一和双重转导的t细胞群的增殖。28.图10‑研究在tgfβ存在或不存在的情况下，单一和双重转导的t细胞群杀伤表达gd2(supt1 gd2)的靶细胞和非表达(supt1 nt)的靶细胞的能力。29.图11‑研究在tgfβ存在或不存在的情况下，与表达gd2(supt1 gd2)的靶细胞和非表达(supt1 nt)的靶细胞共培养后，单一和双重转导的t细胞群的细胞因子产生(ifnγ)。30.图12‑研究在nsg小鼠中建立的神经母细胞瘤异种移植模型中，通过静脉内施用利用双重载体组合物转导的t细胞的抗肿瘤活性的体内测定的结果。将1×106个chla‑255fluc细胞i.v.注射到雌性nsg小鼠中。让异种移植物建立15天，直到通过bli可检测到稳定的植入。car‑t细胞通过用表达gd2 car的单一载体(gd2 car)转导细胞或通过用实施例3中描述并在图7中示出的双重载体组合物(gd2 car+il7 ccr/gd2 car+dshp2+dtgfbrii)转导细胞来制备。以3×106个car t细胞/小鼠的剂量i.v.施用car t细胞。将chla‑255fluc的定量生物发光信号随时间绘制为总通量(光子/秒)。a.显示接受表达单独的gd2 car的car‑t细胞(gd2 car)；未转导的t细胞(nt)或单独的缓冲液(pbs)的小鼠的荧光信号随时间的图。b施用表达单独的gd2 car的car‑t细胞(gd2 car)、未转导的t细胞(nt)或单独的缓冲液(pbs)后的第1、2、7、10和14天获得的小鼠的腹侧图像。c显示接受用实施例3中描述并在图7中示出的双重载体组合物(gd2 car+il7 ccr/gd2 car+dshp2+dtgfbrii)转导的细胞、未转导的t细胞(nt)或单独的缓冲液(pbs)的小鼠的荧光信号随时间的图。d施用用实施例3中描述并在图7中示出的双重载体组合物(gd2 car+il7 ccr/gd2 car+dshp2+dtgfbrii)转导的细胞；未转导的t细胞(nt)或单独的缓冲液(pbs)后的第1、2、7、10和14天获得的小鼠的腹侧图像。31.图13‑(a)示出由在实施例6中所述的三重载体组合物“auto7”中使用的载体表达的分子的示意图。32.载体a表达截短的shp2(dshp2)；安全开关rqr8；基于新型人源化结合物7a12(7a12‑28z)的抗psma car；和显性负性tgfβrii(dntbrii)。33.载体b表达组成型活性il‑7受体(ccr_il7)。34.载体c表达rapacasp9自杀基因(rapacasp9)；cd19(dcd19)和il‑12模块(flexiil‑12)。“2a”是基于fmdv 2a肽的共表达序列。35.(b)三重载体组合物的另一种布置。组分如上述(a)所示。dngfr是截短的神经生长因子受体，其用作标志物蛋白。36.图14‑基于facs的杀伤(fbk)测定的结果，所述fbk测定研究了单一、双重和三重转导的t细胞杀伤表达psma的靶细胞的能力。a：温育24小时后，使用细胞荧光分析法以显示靶细胞存活的fbk。b：通过在24小时从所述的共培养物中收集上清液并通过elisa检测，测量car‑t细胞分泌的il‑2和ifnγ。37.据研究，auto7为：使用载体a的单一转导的产物(“auto7/a”)，或使用载体a和b的双重转导的产物(“auto7/ab”)，或使用载体a、b和c的三重转导的产物(“auto7/abc”)。针对使用相同的抗psma结合物7a12(“亲代”)开发的第二代car测试auto7。38.将工程化以表达不同水平的人psma抗原的supt1靶细胞(supt1‑psma高,supt1‑psma低)用作靶细胞。将非工程化的supt1细胞(supt1‑nt)用作阴性对照。将car t细胞与靶细胞以1:2效应与靶标比率共培养。39.图15‑基于facs的杀伤(fbk)测定结果，所述fbk测定研究了在无细胞因子的完整细胞培养基中培养后，单一、双重和三重转导的t细胞杀伤表达psma的靶细胞的能力。在“饥饿条件(starvation condition)”下培养7天后，将car t细胞与supt1‑psma高和supt1‑psma低靶细胞(或supt1‑nt细胞作为阴性对照)以1:2和1:8效应与靶标比率共培养。a：温育24小时后，使用细胞荧光分析法以显示靶细胞存活的fbk。b：通过在24小时从所述的共培养物中收集上清液并通过elisa检测，测量car t细胞分泌的il‑2和ifnγ。40.图16‑基于facs的杀伤(fbk)测定的结果，所述测定研究了在tgfβ存在或不存在的情况下，单一、双重和三重转导的t细胞杀伤表达psma的靶细胞的能力。在10ng/ml tgfβ1存在或不存在的情况下，以比率1:2和1:8(e:t)将car t细胞与supt1‑psma高和supt1‑psma低靶标共培养7天(supt1‑nt用作对照)。靶细胞杀伤通过facs定量，并针对单独的靶标进行标准化。41.图17‑基于facs的杀伤(fbk)测定的结果，所述测定研究了单一、双重和三重转导的t细胞在用靶细胞重复重新刺激后杀伤表达psma的靶细胞的能力。将转导的t细胞与supt1‑psma高或supt1‑psma低靶细胞以1:1比率(e:t)共培养。每7天用5×104个supt1细胞重新刺激car t细胞。在每次进行新的重新刺激之前，通过facs定量靶细胞杀伤。42.图18‑研究在nsg小鼠中的前列腺癌异种移植模型中通过静脉内施用利用三重载体组合物转导的t细胞的抗肿瘤活性的体内测定。将5×106个psma阳性pc3人细胞系注射到雌性nsg小鼠的侧腹。让异种移植物建立3周，直至通过触诊和卡尺测量可检测到稳定的植入。以1×106个car t细胞/小鼠的剂量i.v.施用car t细胞。卡尺测量每周进行2/3次。a：接受通过使用载体a的单一转导制备的细胞(“auto7/a”)、通过使用载体a和b的双重转导制备的细胞(“auto7/ab”)、通过使用载体a、b和c的三重转导制备的细胞(“auto7/abc”)；或者通过使用相同的抗psma结合物7a12(“亲代”)开发的第二代car制备的细胞的小鼠的数据；b：图18a中所示数据的汇总。43.发明概述44.本发明人已开发了一种组合方法来解决car疗法的肿瘤细胞和微环境异质性问题。45.当同时用多个载体转导细胞时，所得到的产物将是单一转导和组合转导的细胞的混合物。例如，如果用两种载体转导细胞，一种载体包含转基因a，另一种载体包含转基因b，那么转导细胞将是下述细胞的混合物：表达单独的a的细胞；表达单独的b的细胞；以及表达a和b两者的细胞(图5b)。对于用三种载体转导的细胞，其中每种载体包含一种转基因，得到的转导细胞将是下列细胞的混合物：表达单独的a的细胞；表达单独的b的细胞；表达单独的c的细胞；表达a和b的细胞；表达a和c的细胞；表达b和c的细胞；以及表达a、b和c的细胞。46.本发明涉及使用此类混合物作为治疗性car‑t细胞产品。组合产品的使用提供了内在的灵活性，增强了产品适应靶细胞和肿瘤微环境中的差异的能力。47.例如，载体可编码不同car的组合，所述car可以在例如它们的抗原结合结构域和/或共刺激结构域方面有所不同。可选地或另外，载体中的一种或多种可以编码活性调节剂，所述活性调节剂调节car的活性、表达car的细胞的活性或靶细胞的活性。当体内施用组合型car‑t细胞组合物时，所述细胞将迁移到体内不同的肿瘤部位。无论那个car‑t细胞亚群表达car和活性调节剂的特定组合，最适合在该位置存活、持久和杀伤靶细胞的那个亚群，都将比产品中的其它亚群具有选择性优势，并将胜出。以此类方式，car‑t细胞产品可以适应患者之间以及同一患者不同部位之间的肿瘤异质性。48.所述方法还可用于通过分析患者以查看患者中的car‑t细胞的哪个亚群显示出最佳持久性和/或活性来确定哪种载体组合对于产生用于治疗特定疾病或疾病亚型的car‑t细胞是最佳的。49.因此，在第一方面，本发明提供了一种制备细胞组合物的方法，所述方法包括用至少两种病毒载体的混合物转导细胞群的步骤，其中至少一种载体包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列。50.本发明的方法同样可应用于表达工程化t细胞受体的细胞。下文描述的任何及所有方面和实施方案也适用于工程化tcr表达细胞。51.所述混合物可以包含两种、三种、四种、五种或更多种病毒载体。52.混合物中的两种或更多种病毒载体各自可包含编码car的核酸序列。第一car和第二car可以具有不同的抗原结合结构域和/或不同的间隔区和/或不同的胞内域。53.一种或多种病毒载体的编码car的核酸可以编码两个或更多个car。例如，所述核酸可以编码car逻辑门，例如或门。54.本发明提供了一种制备细胞组合物的方法，所述方法包括用至少两种病毒载体的混合物转导细胞群的步骤，其中至少一种载体包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列；并且其中至少一种载体包含编码活性调节剂的核酸，所述活性调节剂调节car的活性、表达car的细胞的活性或靶细胞的活性。55.就涉及活性调节剂的表达而言，本发明的技术同样适用于不表达为car或工程化tcr的过继性细胞治疗用的细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(til)。下文描述的与活性调节剂的表达有关的任何及所有方面和实施方案也一般适用于治疗性t细胞，例如til。56.混合物中的一种或多种病毒载体可以包含编码car和活性调节剂两者的核酸序列，使得用该载体转导的细胞共表达所述car和所述活性调节剂。57.调节car活性的活性调节剂可以影响car表达细胞:靶细胞突触的磷酸化和去磷酸化之间的平衡。例如，活性调节剂可以包括能够磷酸化car胞内域中免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的激酶结构域。58.或者，活性调节剂可以能够招募激酶以使其接近car，在那里可以磷酸化car胞内域中的itam。59.调节car表达细胞活性的活性调节剂可以是细胞内分子，也可以在细胞表面表达。60.在体内，膜结合免疫抑制性受体如ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla1抑制t细胞活化。活性调节剂可以阻断或影响该抑制性途径。61.活性调节剂可以是与抑制性免疫受体结合或与抑制性免疫受体的配体结合的试剂，例如抗体。62.阻断或减少抑制性免疫受体(例如ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla1)所介导的抑制作用的活性调节剂可能会打破t细胞：靶细胞突触的磷酸化和去磷酸化之间的平衡，有利于itam的磷酸化，从而导致t细胞活化。例如，活性调节剂通过蛋白质(例如shp‑1和shp‑2)可以阻断或减少抑制性受体胞内域中itim的磷酸化，或者可以阻断或减少car信号传导结构域中itam的去磷酸化。63.活性调节剂可以是显性负性shp‑1或shp‑2。64.例如，活性调节剂可以是截短的蛋白质，其包含sh2结构域，但缺乏磷酸酶结构域，所述sh2结构域来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)的蛋白质，例如shp‑1或shp‑2。65.活性调节剂可以是细胞因子或趋化因子，例如il12、flexiil‑12、gm‑csf、il7、il15、il21、il2或ccl19。66.或者，活性调节剂可以在car表达细胞中具有细胞因子/趋化因子信号通路的作用。67.例如，活性调节剂可以是包含细胞因子受体胞内域的嵌合细胞因子受体。胞外域可以源自不同的细胞因子受体，也可以不来自细胞因子受体。胞外域可以结合配体，例如肿瘤抗原或分泌的因子。配体的存在可能引起细胞因子受体胞内域的两条链缔合，从而导致细胞因子信号传导。68.活性调节剂可以是组成型活性嵌合细胞因子受体。活性调节剂可以包括两条链，其自发地二聚化或在使两个细胞因子受体胞内域聚集在一起的试剂(二聚化的化学诱导剂或cid)存在下二聚化。69.活性调节剂可以影响jak/stat细胞因子的信号通路。活性调节剂可以包括诱导型或组成型活性信号转导子和转录激活子(stat)或janus激酶(jak)。70.活性调节剂可以是黏附分子或转录因子或包含所述黏附分子或转录因子。转录因子可防止或减少car表达细胞的分化和/或耗竭。71.本发明的活性调节剂可以调节tgfβ信号传导。72.例如，活性调节剂可以阻断或减少tgfβ与tgfβ受体的结合；它可与tgfβ、tgfβr竞争与tgfβr或tgfβ的结合；或者，它可以例如经由smad调节下游的tgfβ信号传导。活性调节剂可以是显性负性tgfβ受体。73.本发明的活性调节剂可以向t细胞提供共刺激信号。74.例如，活性调节剂可以是tnf受体、嵌合tnf受体或tnf受体配体。75.活性调节剂可以调节靶细胞(例如肿瘤细胞)的活性。76.试剂可以是毒素、前药或前药激活化合物。77.活性调节剂可以是酶，其当在细胞中表达或组合表达时能够合成小分子。此类酶或酶的组合在car表达细胞中的表达可以赋予该细胞合成小分子的能力，例如对肿瘤细胞有毒的小分子。78.或者，活性调节剂可以是由car表达细胞分泌的酶。活性调节剂是一种或多种酶，当在细胞表面分泌或表达时，其导致所述工程化细胞的细胞外分子的耗竭，所述外分子；79.(i)是肿瘤细胞生存、增殖、转移或化学抗性所需的，和/或80.(ii)对工程化细胞的存活、增殖或活性有害。81.酶可导致例如氨基酸或氨基酸代谢物、核碱基(如核苷或核苷酸)或脂质的耗竭。82.在本发明的方法中，病毒载体的混合物可以包含至少一种载体，所述载体包含编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列；以及至少另一种载体，所述载体包含编码显性负转化生长因子(tgf)β受体的核酸序列。83.病毒载体的混合物可以包含两种、三种、四种、五种或六种病毒载体，其中至少一种载体包括编码car的核酸序列；且其中至少一种载体包含编码活性调节剂的核酸序列。84.方法可以涉及以下步骤：85.(i)用至少两种病毒载体的混合物转导细胞群；和86.(ii)从步骤(i)的转导的细胞群中选择car表达细胞。87.或者，当混合物中的病毒载体中每一个都包括编码car的核酸序列时，可能不需要从转导的细胞群中选择或纯化car表达细胞。88.在第二方面，本发明提供一种病毒载体组合物。病毒载体组合物可以包括两种或更多载体的混合物。载体组合物可以适用于本发明第一方面的方法中。89.病毒载体组合物可以包括第一载体和第二载体，其两者包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列。90.第一载体表达的car可以与第二载体表达的car相同。例如，第一载体表达的car可以具有与第二载体表达的car相同的抗原结合结构域。91.第一载体和/或第二载体还可表达活性调节剂，所述活性调节剂调节car的活性、表达car的细胞的活性或靶细胞的活性。当第一载体和第二载体都表达活性调节剂时，其两者可以表达不同的活性调节剂或活性调节剂的不同组合。92.例如，第一载体和第二载体可表达一种或多种选自下列的活性调节剂：显性负性shp‑1或shp‑2；显性负性转化生长因子(tgf)β受体；和组成型活性嵌合细胞因子受体。93.在一种布置中，第一载体可以包含编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列和编码显性负性转化生长因子(tgf)β受体的核酸序列；第二载体可以包含编码组成型活性嵌合细胞因子受体的核酸序列。94.在所述第一载体和第二载体编码相同的car的情况下，car可以具有结合双唾液酸神经节苷脂(gd2)的抗原结合结构域。95.第一载体和/或第二载体可以包含编码自杀基因的核酸序列。96.本发明还提供了一种细胞组合物，所述细胞组合物通过本发明的方法制备，或者通过用本发明的载体组合物离体转导细胞制备。97.在第三方面，本发明提供了一种细胞组合物，所述细胞组合物通过根据本发明第一方面的方法制备，或通过用本发明第二方面的病毒载体组合物转导细胞群制备。98.在第四方面，提供了一种用于治疗受试者疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明第三方面的细胞组合物的步骤。99.在第五方面，提供了一种根据本发明第三方面的细胞组合物，其用于治疗和/或预防疾病。100.在第六方面，提供了根据本发明第三方面的细胞组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。101.在第七方面，提供了一种确定表达car的细胞的组分的最佳组合以治疗疾病的方法，所述方法包括以下步骤：102.(i)给患有所述疾病的受试者施用根据本发明第二方面的细胞组合物；103.(ii)监测患者或来自患者的样品，以确定所述细胞组合物中哪种细胞亚群显示出最大水平的移植和/或增殖；和104.(iii)分析所述亚群中细胞的表型/基因型，以确定这些细胞表达的car和/或活性调节剂。105.其它方面106.本发明还提供了在以下编号段落中总结的另外的方面：107.1.核酸构建体，其包含编码显性负性shp‑2的核酸序列和编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。108.2.根据段落1的核酸构建体，其具有以下结构：109.dnshp‑coexpr‑dntgfβr，或110.dntgfβr‑coexpr‑dnshp111.其中：112.dnshp是编码显性负性shp‑2的核酸序列[0113]“coexpr”是能够使两条多肽作为独立实体共表达的核酸序列[0114]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0115]3.根据段落1的核酸构建体，其还包含编码car的核酸序列。[0116]4.根据段落3的核酸构建体，其具有以下结构：[0117]car‑coexpr1‑dnshp‑coexpr2‑dntgfβr[0118]car‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑dnshp[0119]dntgfβr‑coexpr1‑car‑coexpr2‑dnshp[0120]dntgfβr‑coexpr1‑dnshp‑coexpr2‑car[0121]dnshp‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑car，或[0122]dnshp‑coexpr1‑car‑coexpr2‑dntgfβr[0123]其中：[0124]dnshp是编码显性负性shp‑2的核酸序列[0125]“coexpr1”和“coexpr2”可以相同或不同，是能够使三条多肽作为独立实体共表达的核酸序列。[0126]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；和[0127]“car”是编码嵌合抗原受体的核酸序列。[0128]5.根据段落4的核酸构建体，其具有以下结构：[0129]dnshp‑coexpr1‑car‑coexpr2‑dntgfβr[0130]6.根据段落3至5中任一项的核酸构建体，其中所述car结合下列靶抗原之一：cd19、cd22、bcma、psma、cd79、gd2或fcrl5。[0131]7.根据段落3的核酸构建体，其包含编码两个car的双顺反子核酸序列。[0132]8.根据段落7的核酸构建体，其具有以下结构：[0133]dnshp‑coexpr1‑car1‑coexpr2‑car2‑coexpr3‑dntgfβr[0134]其中：[0135]“dnshp”是编码显性负性shp‑2的核酸序列[0136]“coexpr1”、“coexpr2”和“coexpr3”可以相同或不同，是能够使四条多肽作为独立实体共表达的核酸序列；[0137]“car1”是编码第一嵌合抗原受体的核酸序列；[0138]“car2”是编码第二嵌合抗原受体的核酸序列；和[0139]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0140]9.根据段落7或8的核酸构建体，其中一个car结合cd19，且另一个car结合cd22。[0141]10.根据段落6的核酸构建体，其中所述car结合cd19并具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含[0142]a)具有以下序列的互补决定区(cdr)的重链可变区：[0143]cdr1–gyafsss(seq id no.1)；[0144]cdr2–ypgded(seq id no.2)[0145]cdr3–sllygdyldy(seq id no.3)；和[0146]b)具有以下序列的cdr的轻链可变区(vl)：[0147]cdr1–sasssvsymh(seq id no.4)；[0148]cdr2–dtsklas(seq id no.5)[0149]cdr3–sigusoftwninplt(seq id no.6)。[0150]11.根据段落10的核酸构建体，其中所述抗原结合结构域包含具有如seq id no.7所示序列的vh结构域和具有如seq id no.8所示序列的vl结构域。[0151]12.根据前述段落中任一项的核酸构建体，其还包含编码自杀基因的核酸序列。[0152]13.载体，其包含根据前述段落中任一项的核酸构建体。[0153]14.载体试剂盒，其包含根据段落13的第一载体和包含编码嵌合抗原受体(car)或活性调节剂的核酸序列的第二载体。[0154]15.载体试剂盒，其包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码显性负性shp‑2的核酸序列，且所述第二载体包含编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0155]16.根据段落15的载体试剂盒，其中所述第一载体包含编码第一car的核酸序列，且所述第二载体包含编码第二car的核酸序列。[0156]17.根据段落16的载体试剂盒，其中所述第一和第二car具有相同的靶抗原。[0157]18.根据段落16的载体试剂盒，其中所述第一和第二car是相同的。[0158]19.载体试剂盒，其包含根据段落12的第一载体和编码嵌合细胞因子受体(ccr)的第二载体。[0159]20.根据段落19的载体试剂盒，其中所述第一载体包含编码第一car的核酸序列，且所述第二载体包含编码第二car的核酸序列。[0160]21.根据段落20的载体试剂盒，其中所述第一和第二car具有相同的靶抗原。[0161]22.根据段落20的载体试剂盒，其中所述第一和第二car是相同的。[0162]23.根据段落14至22中任一项的载体试剂盒，其中所述第一载体包含编码第一自杀基因的核酸序列，且所述第二载体包含编码第二自杀基因的核酸序列。[0163]24.根据段落23的载体试剂盒，其中所述第一和第二自杀基因由相同的分子触发。[0164]25.根据段落23的载体试剂盒，其中所述第一和第二自杀基因由不同的分子触发。[0165]26.根据段落23至25中任一项的载体试剂盒，其中所述载体具有以下结构：[0166]载体1：car1‑coexpr1‑sg1‑coepr2‑dshp2‑coexpr3‑dntgfβr[0167]载体2：car2‑coexpr4‑sg2‑coepr5‑ccr[0168]其中：[0169]“car1”是编码第一嵌合抗原受体的核酸序列；[0170]“coexpr1”、“coexpr2”、“coexpr3”、“coexpr4”、和“co‑expr5”可以相同或不同，是能够使七条多肽作为独立实体共表达的核酸序列；[0171]“sg1”是编码第一自杀基因的核酸序列；[0172]“dnshp”是编码显性负性shp‑2的核酸序列；[0173]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；[0174]“car2”是编码第二嵌合抗原受体的核酸序列，其可以与car1相同或不同；[0175]“sg2”是编码第一自杀基因的核酸序列，其可以与sg1相同或不同；和[0176]“ccr”是编码嵌合细胞因子受体的核酸序列。[0177]27.根据段落14至26中任一项的载体试剂盒，其还包含第三载体，所述第三载体包含编码细胞因子的核酸序列。[0178]28.根据段落27的载体试剂盒，其中所述细胞因子是il‑12或flexi‑il12。[0179]29.根据段落28的载体试剂盒，其中所述载体具有以下结构：[0180]载体1：dnshp2‑coexpr1‑sg1‑coepr2‑car‑coexpr3‑dntgfβr[0181]载体2：ccr[0182]载体3：sg2‑coexpr4‑flexiil12[0183]其中：[0184]“dnshp”是编码显性负性shp‑2的核酸序列；[0185]“coexpr1”、“coexpr2”、“coexpr3”和“coexpr4”可以相同或不同，是能够使载体1和3上的六条多肽作为独立实体共表达的核酸序列；[0186]“sg1”是编码第一自杀基因的核酸序列；[0187]“car”是编码嵌合抗原受体的核酸序列；[0188]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；[0189]“ccr”是编码嵌合细胞因子受体的核酸序列；[0190]“sg2”是编码第一自杀基因的核酸序列，其可以与sg1相同或不同；和[0191]“flexiil12”是编码flexi‑il‑12的核酸序列。[0192]30.载体组合物，其包含如下的混合物：根据段落13的载体和至少一种其它病毒载体；根据段落14至26中任一项所定义的第一和第二载体；或者根据段落27至29中任一项所定义的第一、第二和第三载体。[0193]31.用于制备细胞组合物的方法，其包括用根据段落13的载体、根据段落14‑29中任一项的载体试剂盒或根据段落30的载体组合物转导细胞群的步骤。[0194]32.细胞，其共表达显性负性shp‑2和显性负性tgfβ受体。[0195]33.根据段落32的细胞，其还表达一种或多种嵌合抗原受体(car)。[0196]34.根据段落33的细胞，其中所述car如段落6至11中任一项所定义。[0197]35.细胞组合物，其通过根据段落31的方法制备，或包含多个根据段落32至34中任一项的细胞。[0198]36.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据段落35的细胞组合物的步骤。[0199]37.根据段落36的方法，其中所述疾病是癌症。[0200]38.根据段落35的细胞组合物，其用于治疗和/或预防疾病。[0201]39.根据段落32至34中任一项的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。[0202]40.核酸构建体，其包含编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；编码il7的核酸序列；和编码ccl19的核酸序列。[0203]41.根据段落40的核酸构建体，其具有以下结构：[0204]dntgfβr‑coexpr1‑il7‑coexpr2‑ccl19；[0205]dntgfβr‑coexpr1‑ccl19‑coexpr2‑il7；[0206]il7‑coexpr1‑ccl19‑coexpr2‑dntgfβr；[0207]il7‑coexpr1‑dntgfβr‑ccl19‑coexpr2；[0208]ccl19‑coexpr1‑il7‑coexpr2‑dntgfβr；或[0209]ccl19‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑il7[0210]其中：[0211]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；[0212]“il7”是编码il7的核酸序列[0213]“ccl19”是编码ccl19的核酸序列[0214]“coexpr1”和“coexpr2”可以相同或不同，是能够使三条多肽作为独立实体共表达的核酸序列。[0215]42.根据段落40的核酸构建体，其还包含编码car的核酸序列。[0216]43.根据段落3的核酸构建体，其具有以下结构：[0217]car‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑il7‑coexpr3‑ccl19；[0218]其中：[0219]“dntgfβr”是编码显性负性tgfβ受体的核酸序列；[0220]“il7”是编码il7的核酸序列[0221]“ccl19”是编码ccl19的核酸序列[0222]“car”是编码嵌合抗原受体的核酸序列[0223]“coexpr1”、“coexpr2”和“coexpr3”可以相同或不同，是能够使四条多肽作为独立实体共表达的核酸序列。[0224]44.根据段落3至5中任一项的核酸构建体，其中所述car结合gd2。[0225]45.载体，其包含根据段落40至44中任一项的核酸构建体。[0226]46.载体试剂盒，其包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码il7的核酸序列和编码ccl19的核酸序列；且所述第二载体包含编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0227]47.根据段落46的载体试剂盒，其中两种载体还包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列。[0228]48.根据段落47的载体试剂盒，其中所述第一载体编码的car与所述第二载体编码的car相同。[0229]49.根据段落48的载体试剂盒，其中所述car结合gd2。[0230]50.用于制备细胞组合物的方法，其包括用根据段落45的载体或根据段落46至49中任一项的载体试剂盒转导细胞群的步骤。[0231]51.细胞，其共表达显性负性tgfβ受体、il7和ccl19。[0232]52.根据段落51的细胞，其还表达一种或多种嵌合抗原受体(car)。[0233]53.细胞组合物，其通过根据段落46的方法制备，或包含多个根据段落51或52的细胞。[0234]54.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据段落49的细胞组合物的步骤。[0235]55.根据段落54的方法，其中所述疾病是癌症。[0236]56.根据段落53的细胞组合物，其用于治疗和/或预防疾病。[0237]57.根据段落51或52中任一项的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。[0238]在上述段落和下文的权利要求中，核酸构建体或载体的多肽编码件，如“dnshp”、“dntgfβr”、“il7”、“ccl19”和“car”，在构建体中可以是任意顺序。[0239]以下与核酸和多肽序列、多肽组分、载体、细胞方法等相关的详细描述同样适用于上述段落中阐述的方面以及权利要求书中本发明的方面。[0240]发明详述[0241]本发明涉及一种用于制备细胞组合物的方法，所述方法包括用至少两种病毒载体的混合物转导细胞群的步骤。[0242]病毒载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。[0243]逆转录病毒是双链rna包膜病毒，其主要特征是能够将其基因组从rna“逆‑转录”为dna。病毒体直径为100‑120nm，且包含与核衣壳蛋白复合的相同正链rna的二倍体基因组。所述基因组包封在蛋白质衣壳中，所述衣壳中还含有病毒感染所需的酶蛋白，即逆转录酶、整合酶和蛋白酶。基质蛋白形成衣壳核心的外层，其与包膜相互作用，包膜是来源于宿主细胞膜的脂质双层，其包围着病毒核心颗粒。锚定在这个双层上的是负责识别宿主细胞上的特异性受体并启动感染程序的病毒包膜糖蛋白。包膜蛋白由两个亚单位形成：将蛋白质锚定在脂质膜上的跨膜(tm)和与细胞受体结合的表面(su)。[0244]基于基因组结构，逆转录病毒分为简单逆转录病毒，如mlv病毒和鼠白血病病毒；或复杂逆转录病毒，如hiv和eiav。逆转录病毒编码四种基因：gag(群特异性抗原)、pro(蛋白酶)、pol(聚合酶)和env(包膜)。gag序列编码三种主要的结构蛋白：基质蛋白、核衣壳蛋白和衣壳蛋白。pro序列编码负责在颗粒组装、出芽和成熟期间切割gag和gag‑pol的蛋白酶。pol序列编码逆转录酶和整合酶，前者在感染过程中催化病毒基因组从rna逆转录为dna，后者负责将前病毒dna整合到宿主细胞基因组中。env序列编码包膜糖蛋白的su和tm亚单位。此外，逆转录病毒基因组呈现非编码顺式作用序列，例如：两个ltr(长末端重复序列)，其包含驱动基因表达、逆转录和整合到宿主细胞染色体所需的件；将病毒rna特异性包装到新形成的病毒体中所需的名为包装信号(ψ)的序列；和在逆转录过程中充当启动正链dna合成的位点的多嘌呤序列(ppt)。除了gag、pro、pol和env之外，复杂逆转录病毒(例如慢病毒)具有辅助基因，包括vif、vpr、vpu、nef、tat和rev，其调控病毒基因表达、感染性颗粒的组装，并调节感染细胞中的病毒复制。[0245]在感染过程期间，逆转录病毒最初附着于特异性细胞表面受体。在进入易感宿主细胞后，逆转录病毒rna基因组通过病毒编码的逆转录酶复制到dna上，所述逆转录酶携带在亲代病毒中。该dna被转运到宿主细胞核，随后在那里整合到宿主基因组中。在这个阶段，其通常被称为前病毒。前病毒在细胞分裂期间在宿主染色体中是稳定的，并像其它细胞蛋白质一样被转录。前病毒编码制造更多病毒所需的蛋白质和包装机械，这些病毒可以通过一种称为“出芽”的过程离开细胞。[0246]当包膜病毒(例如逆转录病毒和慢病毒)从宿主细胞中出芽时，它们会占据宿主细胞脂质膜的一部分。以此方式，宿主细胞衍生的膜蛋白成为逆转录病毒颗粒的一部分。本发明利用这一过程将目的蛋白质引入病毒颗粒的包膜中。[0247]病毒载体[0248]逆转录病毒和慢病毒可用作将一个或多个核酸序列转移到靶细胞用的载体或递送系统。所述转移可以发生在体外、离体或体内。当以此类方式使用时，这些病毒通常被称为病毒载体。[0249]gamma‑逆转录病毒载体，通常称为逆转录病毒载体，是在1990年基因治疗临床试验中使用的第一种病毒载体，并且现在仍然是使用最多的载体之一。最近，由于慢病毒载体能够转导非分裂细胞，人们对源自复杂逆转录病毒(例如人类免疫缺陷病毒(hiv))的慢病毒载体的兴趣越来越大。逆转录病毒和慢病毒载体作为基因转移工具的最有吸引力的特征包括：具有大的遗传有效载荷(高达9kb)的能力、最小的患者免疫反应、体内和体外的高转导效率，以及永久修饰靶细胞的遗传内容的能力、维持递送基因的长期表达的能力。[0250]逆转录病毒载体可以基于能够向真核细胞传递遗传信息的任何合适的逆转录病毒。例如，逆转录病毒载体可以是α逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、慢病毒载体或泡沫逆转录病毒(spumaretroviral)载体。这样的载体已经广泛用于基因治疗和其它基因递送应用中。[0251]本发明的病毒载体可以是逆转录病毒载体，例如γ‑逆转录病毒载体。所述病毒载体可以基于人类免疫缺陷病毒。[0252]本发明的病毒载体可以是慢病毒载体。所述载体可以基于非灵长类慢病毒，例如马传染性贫血病毒(eiav)。[0253]核酸序列和构建体[0254]在本发明方法中使用的病毒载体混合物中，每个载体可以包含一个或多个核酸序列。例如，混合物中的一种或多种载体可以包含核酸构建体，所述核酸构建体包含多个共表达的核酸序列。核酸构建体可以是例如双顺反子或三顺反子。所述核酸构建体可以包含2、3、4或5个转基因。[0255]核酸构建体中的核酸序列可以被“共表达”序列分开，使得两条或更多条多肽一旦被翻译，就能够在细胞中或细胞上分开表达。[0256]共表达序列可以编码切割位点，使得核酸构建体产生包含由切割位点连接的两条或更多条多肽。切割位点可以是自切割的，使得当多肽产生时，其立即被切割成单个多肽，而不需要任何外部切割活性。[0257]切割位点可以是能够使两条或更多条多肽分离的任何序列。[0258]为了方便起见，本文中使用术语“切割”，但是切割位点可以通过不同于经典切割的机制使多肽分离成单个实体。例如，例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽(见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：通过宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自蛋白分解或翻译效应(donnelly et al(2001)j.gen.virol.82:1027‑1041)。此类“切割”的确切机制对于本发明的目的来说并不重要，只要切割位点位于编码蛋白质的核酸序列之间时，能使得所述蛋白质作为单独的实体表达。[0259]切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)切割位点。[0260]弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。这个家族的成员是将潜在的前体蛋白加工成它们的生物活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内蛋白酶，其能够在成对的碱性氨基酸加工位点处有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素、转化生长因子β1前体、前白蛋白、前β‑分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、前神经生长因子β亚单位和血管性血友病因子。弗林蛋白酶切割就在碱性氨基酸靶序列下游的蛋白质(规范形式为，arg‑x‑(arg/lys)‑arg'(seq id no.58))，并在高尔基体中富集。[0261]切割位点可以是烟草蚀刻病毒(tev)切割位点。[0262]tev蛋白酶是一种高度序列特异性半胱氨酸蛋白酶，其是糜蛋白酶样蛋白酶。它对其靶切割位点极具特异性，因此经常用于体外和体内融合蛋白的可控切割。共有tev切割位点是enlyfqs(其中‘’表示切割的肽键)(seq id no.59)。哺乳动物细胞(例如人类细胞)不表达tev蛋白酶。因此，在本发明核酸构建体包含tev切割位点并在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，外源tev蛋白酶也必须在哺乳动物细胞中表达。[0263]切割位点可以编码自切割肽。[0264]“自切割肽”是指这样一种肽，其功能使得当产生包含蛋白质和自切割肽的多肽时，所述多肽立即被“切割”或分离成明显不同且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。[0265]自切割肽可以是来自口疮或心脏病毒的2a自切割肽。口疮和心脏病毒的主要的2a/2b切割是在其自己的c端通过2a“切割”介导的。在口疮病毒(例如口蹄疫病毒(fmdv)和马鼻炎a病毒)中，2a区是大约18个氨基酸的一小段，它与蛋白质2b的n端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表能够在其自己的c端介导“切割”的自主件(donelly等人(2001)，如上所述)。[0266]已在口疮或心脏病毒之外的小核糖核酸病毒、“小核糖核酸样”昆虫病毒、c型轮状病毒和锥虫属中的重复序列以及细菌序列中发现“2a样”序列(donelly等人(2001)，如上所述)。[0267]切割位点可以包含seq id no.9所示的2a样序列。[0268]seq id no.9[0269]raegrgslltcgdveenpgp[0270]本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列和编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0271]显性负性shp‑1或shp‑2和tgfβ受体将在下文详细描述。[0272]核酸构建体可具有以下结构:[0273]dnshp‑coexpr‑dntgfβr，或[0274]dntgfβr‑coexpr‑dnshp[0275]其中：[0276]dnshp是编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列[0277]“coexpr”是能够使两条多肽作为独立实体共表达的核酸序列[0278]dntgfβr是显性负性tgfβ受体。[0279]核酸构建体也可以包含编码car的核酸序列。在这种情况下，核酸构建体可以具有以下结构：[0280]car‑coexpr1‑dnshp‑coexpr2‑dntgfβr[0281]car‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑dnshp[0282]dntgfβr‑coexpr1‑car‑coexpr2‑dnshp[0283]dntgfβr‑coexpr1‑dnshp‑coexpr2‑car[0284]dnshp‑coexpr1‑dntgfβr‑coexpr2‑car，或[0285]dnshp‑coexpr1‑car‑coexpr2‑dntgfβr[0286]其中：[0287]dnshp是编码显性负性shp‑2的核酸序列[0288]“coexpr1”和“coexpr2”可以相同或不同，它们是能够使三条多肽作为独立实体共表达的核酸序列。[0289]dntgfβr是显性负性tgfβ受体；以及[0290]car是编码嵌合抗原受体的核酸序列。[0291]自杀基因[0292]核酸构建体也可以包含编码自杀基因的核酸。[0293]由于t细胞移植且是自主的，因此需要选择性删除患者体内car‑t细胞的方法。自杀基因是基因可编码的机制，在不可接受的毒性面前，它导致输注的t细胞选择性破坏。自杀基因的最早的临床经验是疱疹病毒胸苷激酶(hsv‑tk)，它使t细胞对更昔洛韦易感。hsv‑tk是一种高效的自杀基因。然而，预先形成的免疫反应可能限制其在重要的免疫抑制的临床环境中的应用，例如单倍体相合干细胞移植。诱导型胱天蛋白酶9(icasp9)是通过用修饰的fkbp12取代胱天蛋白酶9的激活结构域而构建的自杀基因。icasp9或者被惰性小分子化学诱导剂激活二聚化(cid)。近来icasp9在单倍体相合hsct环境中进行了测试，且可以中止gvhd。icasp9和hsv‑tk都是细胞内蛋白质，因此当用作唯一的转基因时，它们已经与标志物基因共表达，以允许选择转导细胞。[0294]wo2016/135470描述了一种自杀基因，其还包含胱天蛋白酶9，但是可以使用雷帕霉素或雷帕霉素类似物诱导其二聚化。[0295]该自杀基因，有时称为rapcasp9或rapacasp9，其氨基酸序列如seq id no.80所示。[0296]seq id no.80(rapcasp9)[0297]……………[0298]wo2013/153391描述了一种称为rqr8的标志物/自杀基因，其可以用抗体qbend10和用治疗性抗体利妥昔单抗(rituximab)裂解的表达细胞检测。[0299]分选/自杀基因rqr8的氨基酸序列如seq id no.79所示。[0300]seq id no.79(rqr8)[0301]cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpvv[0302]在本发明的病毒载体组合物的一种或多种载体中包含自杀基因能够选择性消融受试者体内的一部分转导细胞。[0303]例如，对于两种载体a和b，转导细胞将是单独用载体a转导的细胞、单独用载体b转导的细胞和用载体a和b两者转导的细胞的混合物。如果载体a表达或共表达自杀基因，那么激活自杀基因将导致单独用载体a转导的细胞或用载体a和b转导的细胞的删除，但单独用载体b转导的细胞将保留。[0304]这在混合物中的一种载体编码潜在危险或有毒基因的情况下特别有用。如果自杀基因包含在所述载体的盒中，那么在患者发生不可接受的免疫或毒性事件时，可以通过触发自杀基因来选择性地删除表达问题基因的细胞。表达不包括潜在危险基因/自杀基因组合的其它载体组合的细胞得以保留，并能持续其治疗效果。[0305]例如，自杀基因可以包含在表达免疫调节细胞因子(例如白介素‑12)或组成型活性细胞因子受体的载体中(参见下文)。[0306]病毒载体组合物[0307]本发明提供了包含混合物病毒载体的病毒载体组合物。组合物可以通过简单地混合两种或更多种病毒载体来制备。组合物可以包含2至10种病毒载体，例如2、3、4、5或6种病毒载体。[0308]混合物中的病毒载体每一种可以包含一个或多个转基因。组合物中的两种或更多种病毒载体可以在一个或多个转基因中重叠。例如，组合物中的两种病毒载体可以包含编码相同car的核酸序列，但是在存在由其它核酸序列编码的活性调节剂类型的情形下可以不同。[0309]组合物中的一种或多种病毒载体可以包含编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列。组合物中的一种或多种病毒载体可以包含编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。组合物中的一种或多种病毒载体可以包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。[0310]病毒载体组合物可以包含载体，所述载体包含编码显性负性shp‑1或shp‑2的核酸序列和编码显性负性tgfβ受体的核酸序列。[0311]病毒载体组合物可以包含多种载体，其中每一种编码不同的活性调节剂或活性调节剂组合。[0312]嵌合抗原受体[0313]在本发明的方法中，病毒载体混合物中的至少一种载体可以包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列。[0314]嵌合抗原受体(car)[0315]图1中示意性所示的car是嵌合i型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)与细胞内信号传导结构域(胞内域)连接。结合物通常是来源于单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但是它也可以基于包含抗体样抗原结合位点的其它形式。间隔区结构域通常是必需的，以将结合物与膜隔离，并使其具有合适的方向。常见的间隔区结构域为igg1的fc。也可以有更紧密的间隔区，例如来自cd8α的茎区，甚至仅只是igg1铰链，这取决于抗原。跨膜结构域将蛋白质锚定于细胞膜中，并将间隔区与胞内域连接。[0316]早期的car设计具有来源于fcεr1或cd3ζ的γ链的胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传递免疫信号1，这样足以触发t细胞杀伤同源靶细胞，但不能完全激活t细胞增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：将t细胞共刺激分子的胞内部分与cd3ζ的胞内部分融合以产生第二代受体，所述受体可以在识别抗原后同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是cd28的。这提供了最有效的共刺激信号，即免疫信号2，从而触发t细胞增殖。还描述了包括tnf受体家族胞内域的一些受体，例如传递存活信号的密切相关的ox40和41bb。如今已经描述了更有效的第三代car，其具有能够传递激活、增殖和存活信号的胞内域。[0317]可以使用例如逆转录病毒或慢病毒载体将编码car的核酸转移至t细胞，以产生用于过继性细胞转移的癌症特异性t细胞。当car与靶抗原结合时，这导致激活信号传递给表达它的t细胞。因此，car将t细胞的特异性和细胞毒性导向表达靶抗原的肿瘤细胞。[0318]串联car(tancar)[0319]双特异性car，又称为串联car或tancar，已被开发用于同时靶向两种或更多种癌症特异性标志物。在tancar中，胞外结构域包含通过接头串联连接的两个抗原结合特异性部分。因此，两个结合特异性部分(scfv)都连接到单个跨膜部分：一个scfv与膜并置，另一个在远端位置。当tancar结合其中一个或两个靶抗原时，这导致激活信号传递到表达它的细胞。[0320]grada et al(2013,mol ther nucleic acids 2:e105)描述了一种tancar，其包括cd19特异性scfv，后接gly‑ser接头，然后接her2特异性scfv。her2‑scfv靠近膜的位置，而cd19‑scfv远离膜的位置。tancar已显示针对两种肿瘤限制性抗原的每一种能诱导不同的t细胞反应性。选择这种布置是因为her2(632)和cd19(280aa,)各自的长度使其本身适合该空间布置。还已知her2 scfv结合her2最远端的4个环。[0321]抗原结合结构域[0322]抗原结合结构域是识别抗原的car的部分。本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体、抗体类似物和t细胞受体的抗原结合位点的那些抗原结合结构域。例如，抗原结合结构域可以包含：源于单克隆抗体的单链可变片段(scfv)；靶抗原的天然配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单一结构域抗体；人工单一结合物，例如darpin(经设计的锚蛋白重复蛋白)；或源于t细胞受体的单链。[0323]在经典的car中，抗原结合结构域包含：源自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)(见图4c)。也已经用结构域抗体(dab)或vhh抗原结合结构域(见图4b)产生car或其包含例如单克隆抗体的fab片段(见图4a)。fabcar包含两条链：一条具有抗体样轻链可变区(vl)和恒定区(cl)的链；和一条具有重链可变区(vh)和恒定区(ch)的链。一条链还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。cl和ch之间的联结导致受体的组装。[0324]fab car的两条链可以具有以下一般结构：[0325]vh‑ch‑间隔区‑跨膜结构域‑细胞内信号传导结构域；和[0326]vl‑cl[0327]或[0328]vl‑cl‑间隔区‑跨膜结构域‑细胞内信号传导结构域；和[0329]vh‑ch[0330]对于fab型嵌合受体，抗原结合结构域由来自一条多肽链的vh和来自另一条多肽链的vl组成。[0331]多肽链可以包含在vh/vl结构域和ch/cl结构域之间的接头。接头可以是柔性的，且用于在空间上将vh/vl结构域与ch/cl结构域分开。[0332]car的抗原结合结构域可以结合肿瘤相关的抗原。各种肿瘤相关的抗原(taa)是已知的，例如如下表1所示。[0333]表1[0334]癌症类型taa弥漫大b细胞淋巴瘤cd19、cd20、cd22乳腺癌erbb2、muc1amlcd13、cd33神经母细胞瘤gd2、ncam、alk、gd2b‑cllcd19、cd52、cd160结直肠癌叶酸结合蛋白、ca‑125慢性淋巴细胞性白血病cd5、cd19胶质瘤egfr、波形蛋白多发性骨髓瘤bcma、cd138肾细胞癌碳酸酐酶ix、g250前列腺癌psma肠癌a33[0335]所述car或每种car可以结合下列靶抗原之一：cd19、cd22、bcma、psma、gd2、cd79或fcrl5。[0336]cd19[0337]与cd19结合的car的抗原结合结构域可以包含源于表2中所示的cd19结合物之一的序列。[0338]表2[0339][0340]或者，结合cd19的car可以具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：[0341]a)具有以下序列的互补决定区(cdr)的重链可变区：[0342]cdr1–gyafsss(seq id no.1)；[0343]cdr2–ypgded(seq id no.2)[0344]cdr3–sllygdyldy(seq id no.3)；和[0345]b)具有以下序列的cdr的轻链可变区(vl)：[0346]cdr1–sasssvsymh(seq id no.4)；[0347]cdr2–dtsklas(seq id no.5)[0348]cdr3–sigusoftwninplt(seq id no.6)。[0349]抗原结合结构域可以包含具有seq id no.7所示序列的vh结构域和具有seq id no.8所示序列的vl结构域。[0350]seq id no.7–vh序列[0351]qvqlsigusoftsgpelvkpgasvkisckasgyafssswmnwvkqrpgkglewigriypgdedtnysgkfkdkatltadkssttaymqlssltsedsavyfcarsllygdyldywgqgttltvss[0352]seq id no 8–vl序列[0353]qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymhwysigusoftksgtspkrwiydtsklasgvpdrfsgsgsgtsyfltinnmeaedaatyycsigusoftwninpltfgagtklelkr[0354]cd22[0355]与cd22结合的car可以具有源自m971、ha22或bl22的抗原结构域，如haso et al.(blood；2013；121(7))所述。[0356]或者，与cd22结合的car可以具有如英国申请案第1809773.3号中所述的抗原结合结构域，例如包含以下的抗原结合结构域：[0357]a)具有以下序列的互补决定区(cdr)的重链可变区：[0358]cdr1‑nfama(seq id no.10)[0359]cdr2‑sistgggntyyrdsvkg(seq id no.11)[0360]cdr3‑qrnyydgsydyegytmda(seq id no.12)；和[0361]b)具有以下序列的互补决定区(cdr)的轻链可变区：[0362]cdr1‑rssqdignylt(seq id no.13)[0363]cdr2‑gaikled(seq id no.14)[0364]cdr3‑lqsiqyp(seq id no.15)[0365]cd22 car的抗原结合结构域可以包含具有seq id no.16所示序列的vh结构域；和具有seq id no.17所示序列的vl结构域。[0366]seq id no.16[0367]evqlvesggglvqpgrslklscaasgftfsnfamawvrqpptkglewvasistgggntyyrdsvkgrftisrddakntqylqmdslrsedtatyycarqrnyydgsydyegytmdawgqgtsvtvss[0368]seq id no.17[0369]diqmtqspsslsaslgdrvtitcrssqdignyltwfsigusoftkvgrsprrmiygaikledgvpsrfsgsrsgsdysltisslesedvadyqclqsiqypftfgsgtkleik[0370]bcma[0371]许多靶向bcma的car正在临床开发中，包括bb2121、lcar‑b38m、mcarh171、jcarh125、p‑bcma‑101、fcarh143、bb21217和ct053。[0372]wo2015/052538描述了一种靶向bcma的car，其中抗原结合结构域源于增殖诱导配体(april)，其是bcma的天然配体。[0373]英国专利申请案第1815775.0号描述了针对14个bcma结合结构域的vh和vl结构域及其在car中的用途。[0374]psma[0375]表达对前列腺特异性膜抗原(psma)有特异性的car的t细胞目前正在用于治疗前列腺癌的临床试验中(junhans et al(2016)prostate 76:1257‑1270)。[0376]gd2[0377]已经开发了与双唾液酸神经节苷脂结合(gd2)的car，所述双唾液酸神经节苷脂是含唾液酸的鞘糖脂。此类car例如可以基于gd2结合物14g2a或huk666，如wo2015/132604中所述。[0378]与gd2结合的car可以具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：[0379]a)具有以下序列的互补决定区(cdr)的重链可变区：[0380]cdr1–synih(seq id no.71)；[0381]cdr2–viwaggstnynsalms(seq id no.72)[0382]cdr3–rsddyswfay(seq id no.73)；和[0383]b)具有以下序列的cdr的轻链可变区(vl)：[0384]cdr1–rasssvsssylh(seq id no.74)；[0385]cdr2–stsnlas(seq id no.75)[0386]cdr3–sigusoftysgypit(seq id no.76)。[0387]gd2结合结构域可以包含具有如seq id no.77所示序列的vh结构域；和/或具有如seq id no.78所示序列的vl结构域。[0388]seq id no.77(人源化km666 vh序列)[0389]qvqlqesgpglvkpsqtlsitctvsgfslasynihwvrqppgkglewlgviwaggstnynsalmsrltiskdnsknqvflkmssltaadtavyycakrsddyswfaywgqgtlvtvss[0390]seq id no.78(人源化km666 vh序列)[0391]enqmtqspsslsasvgdrvtmtcrasssvsssylhwysigusoftksgkapkvwiystsnlasgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycsigusoftysgypitfgqgtkveik[0392]fcrl5[0393]市售的针对fcrl5的单克隆抗体是已知的，例如cd307e(thermofisher)和rea391(miltenyi biotec)。[0394]wo2016090337描述了与fcrl5结合的几种scfv型抗原结合结构域。[0395]英国专利申请案第1815775.0号描述了抗fcrl5 car。[0396]cd79[0397]许多抗cd79抗体先前已有描述，例如jcb117、sn8、cb3.1、2f2(泊洛妥珠单抗polatuzumab)。[0398]英国申请案第1807870.9号描述了各种cd79 car。[0399]在病毒载体的组合物包括一个以上包含编码car的核酸序列的载体的情况下，car可以具有不同的抗原结合结构域。car可以识别不同的抗原，或者car可以结合相同的抗原，但是具有不同的抗原结合结构域。结合相同抗原但具有不同抗原结合结构域的car可以结合抗原的不同表位和/或可以具有不同的亲和力和/或开/关速率。[0400]car对靶抗原的亲和力和/或其开关速率会影响car杀伤靶细胞的能力。例如，据美国2018/0064785中所报道，来源于具有快速开启速率(on‑rate)和快速关闭(off‑rate)速率的抗体的car允许car‑t细胞更好地连续杀伤靶细胞。通过给予患者包含多种针对靶抗原的car的car‑t细胞组合物，具有最适合杀伤患者体内或患者体内特定部位靶细胞的抗原结合结构域的car将接收激活/存活/增殖信号并将获胜。本发明的组合物在这方面提供了灵活性，甚至允许具有不同car的car‑t细胞亚群在同一患者体内的不同部位“胜出”。[0401]细胞内t细胞信号传导结构域(胞内域)[0402]car可以包含激活胞内域—car的信号传输部分，或与其缔合。识别抗原后，受体聚集，并将信号传递给细胞。最常用的胞内域组分是含有3个itam的cd3‑ζ胞内域。其在结合抗原后向t细胞传递激活信号。cd3‑ζ可能不能提供完全胜任的激活信号，且有可能需要额外的共刺激信号传导。例如，嵌合cd28和ox40可以与cd3‑ζ一起用于传递增殖/存活信号，或者这三者可以一起使用。[0403]car的胞内域可以包括cd28胞内域和ox40和cd3‑ζ胞内域。[0404]胞内域可以包含：[0405](i)含itam的内结构域，例如来自cd3‑ζ的胞内域；和/或[0406](ii)共刺激结构域，例如来自cd28的胞内域；和/或[0407](iii)传递存活信号的结构域，例如tnf受体家族胞内域，诸如ox‑40或4‑1bb。[0408]在本发明中，含有itam基序的胞内域可以用作活化胞内域。已知几种蛋白质含有具有一个或多个itam基序的胞内域。此类蛋白质的实例包括cd3 epsilon链、cd3 gamma链和cd3 delta链等。itam基序可以很容易地识别为与亮氨酸或异亮氨酸被任何两个其它氨基酸分开的酪氨酸，从而产生了标志yxxl/i(seq id no.60)。通常(但不总是如此)，这些基序中的两个基序在分子尾部被6到8个氨基酸分开(yxxl/ix(6‑8)yxxl/i)。因此，本领域技术人员可以容易地找到含有一个或多个itam的现有蛋白质来传递激活信号。此外，鉴于基序简单且不需要复杂的二级结构，本领域技术人员可以设计含有人工itam的多肽来传递激活信号(参见wo 2000/063372，其涉及合成信号传导分子)。[0409]已经描述了许多系统，其中car的抗原识别部分在与信号传输部分分离的分子上，例如wo015/150771；wo2016/124930和wo2016/030691中描述的那些。本发明方法中使用的一种或多种病毒载体可以编码此类“分裂car”。或者，一种载体可以包含编码抗原识别部分的核酸序列，且一种载体可以包含编码细胞内信号传导结构域的核酸序列。[0410]在病毒载体的组合物包括一个以上包含编码car的核酸序列的载体的情况下，car可以具有不同的胞内域或不同的胞内域组合。例如，一个car可以是第二代car，且一个car可以是第三代car。或者，两个car都可以是第二代car，但可以具有不同的共刺激结构域。例如，不同的第二代car信号传导结构域包括：41bb‑cd3ζ；ox40‑cd3ζ和cd28‑cd3ζ。[0411]信号肽[0412]载体组合物中的一个或多个核酸序列可以编码信号肽，使得当car或活性调节剂在细胞内表达时，初生蛋白被导向内质网，随后被导向细胞表面，并在那里表达(或分泌)。[0413]信号肽的核心可能含有一长段疏水性氨基酸，所述氨基酸倾向于形成单一的α‑螺旋。信号肽可能始于一小段带正电荷的氨基酸，这有助于在易位过程中增强多肽的适当的拓扑结构。在信号肽的末端，通常存在被信号肽酶识别和切割的一段氨基酸。信号肽酶可以在易位过程中或完成后裂解，产生游离信号肽和成熟蛋白。然后游离的信号肽被特定的蛋白酶消化。[0414]信号肽可以位于分子的氨基末端。[0415]car可具有以下通式：[0416]信号肽‑抗原结合结构域‑间隔区结构域‑跨膜结构域‑细胞内t细胞信号传导结构域(胞内域)。[0417]间隔区[0418]car可以包含间隔区序列，以连接抗原结合结构域和跨膜域，并在空间上将抗原结合结构域与胞内域分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向定向，以实现抗原结合。[0419]间隔区序列可以例如包含igg1 fc区、igg1铰链或cd8茎区，或其组合。或者，间隔区可以包含替代序列，所述替代序列具有与igg1 fc区、igg1铰链或cd8茎区相似的长度和/或结构域间隔特性。[0420]在病毒载体的组合物包括一个以上包含编码car的核酸序列的载体的情况下，car可以具有不同的间隔区。[0421]或门[0422]本发明的细胞组合物可以包含两种或更多种car。这可以是用两种或更多种载体转导的结果，每种载体包含编码car的核酸序列；或者也可以是单一载体转导的结果，所述单一载体包含编码两种或更多种car的核酸构建体。[0423]car可以与一种或多种其它激活性或抑制性嵌合抗原受体组合使用。例如，它们可以与“逻辑门”中的一种或多种其它car组合使用，所述“逻辑门”是一种car组合，当由细胞(例如t细胞)表达时，所述car组合能够检测至少两种靶抗原的特定表达模式。如果至少两种靶抗原任意表示为抗原a和抗原b，则三种可能的选择如下：[0424]“或门”——当靶细胞上存在抗原a或抗原b时，t细胞触发[0425]“与门”——只有在靶细胞上同时存在抗原a和抗原b两者时，t细胞才会触发[0426]“与非门”——如果抗原a单独存在于靶细胞上，t细胞就会触发，但如果抗原a和b都存在于靶细胞上，则t细胞就不会触发。[0427]表达这些car组合的工程化t细胞可以基于其两种或多种标志物的特定表达(或缺乏表达)而定制为对癌细胞具有敏锐的特异性。[0428]例如，在wo2015/075469、wo2015/075470和wo2015/075470中描述了此类“逻辑门”。[0429]“或门”包括两个或多个激活性car，每个激活性car指向由靶细胞表达的不同靶抗原。或门的优点是靶细胞上有效的可靶向抗原增加，因为它实际上是抗原a +抗原b。这对于在靶细胞上以可变或低密度表达的抗原尤其重要，因为单个抗原的水平可能低于car‑t细胞有效靶向所需的阈值。而且，它避免了抗原逃逸的现象。例如，一些淋巴瘤和白血病在cd19靶向后变成cd19负性：一旦出现此类情况，使用或门提供“备份”抗原，所述或门靶向cd19与另一抗原的组合。如wo2016/102965中所述，“备份”抗原可以是cd22。[0430]活性调节剂[0431]在本发明的方法中，病毒载体混合物中的至少一种载体可以包含编码活性调节剂的核酸序列。在这种情况下，本发明的表达car的细胞组合物中的至少一部分转导细胞将表达一种或多种活性调节剂。活性调节剂是由car表达细胞制备的分子，其调节car的活性、表达car的细胞的活性或靶细胞的活性。[0432]活性调节剂可以是在细胞表面表达的细胞内分子，或通过car表达细胞分泌。[0433]调节car的活性[0434]1.增强itam磷酸化[0435]在t细胞体内活化过程中(如图2a中示意性所示)，通过t细胞受体(tcr)的抗原识别导致cd3ζ上免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的磷酸化。磷酸化的itam被zap70 sh2结构域识别，从而导致t细胞活化。[0436]t细胞活化利用动力学分离将tcr的抗原识别转化为下游激活信号。简而言之：在基态，t细胞膜上的信号传导成分处于动态自稳，因此去磷酸化的itam比磷酸化的itam更有利。这是由于跨膜cd45/cd148磷酸酶相比膜栓系激酶(例如lck)具有较高的活性。当t细胞通过t细胞受体(或car)识别同源抗原而与靶细胞结合时，就会形成紧密的免疫突触。这种紧密并列的t细胞和靶膜排除了cd45/cd148，因为它们巨大的胞外域不能纳入所述突触中。在没有磷酸酶的情况下，突触中高浓度的t细胞受体相关的itam和激酶的分离导致磷酸化的itam更有利的状态。zap70识别磷酸化itam的阈值并传播t细胞活化信号。[0437]这一过程在car介导的t细胞活化期间基本相同。激活的car在其细胞内信号传导结构域中包含一个或多个itam，这通常是因为所述信号传导结构域包含cd3ζ的胞内域。car的抗原识别导致car信号传导结构域中的itam磷酸化，从而引起t细胞活化。[0438]如图2b中示意性所示，抑制性免疫受体(例如pd1)引起磷酸化的itam的去磷酸化。pd1的胞内域中含有itim，所述itim被诸如ptpn6(shp‑1)和shp‑2分子的sh2结构域识别。识别后，ptpn6被招募到近膜区，且其磷酸酶结构域随后对抑制免疫激活的itam结构域去磷酸化。[0439]能够调节car活性的活性调节剂可以直接或间接磷酸化car信号传导结构域中的itam。[0440]1.1提供或招募激酶[0441]例如，活性调节剂可以是膜靶向分子，其包含激酶结构域或者能够将包含激酶结构域的单独的分子招募到car附近。wo2018/193231描述了具有此类“磷酸化扩增胞内域”的各种分子。[0442]能够直接磷酸化itam的活性调节剂可以包含酪氨酸激酶结构域，如src家族激酶的激酶结构域，其实例包括fyn、src、lck或其衍生物，如lck(y505f)。fyn、src、lck和lck(y505)的酪氨酸激酶结构域分别如下文seq id no.18‑21所示。[0443]fyn酪氨酸激酶结构域(seq id no:18)[0444]lqlikrlgngqfgevwmgtwngntkvaiktlkpgtmspesfleeaqimkklkhdklvqlyavvseepiyivteymnkgslldflkdgegralklpnlvdmaaqvaagmayiermnyihrdlrsanilvgnglickiadfglarliedneytarqgakfpikwtaperalygrftiksdvwsfgilltelvtkgrvpypgmnnrevleqvergyrmpcpqdcpislhelmihcwkkdpeerptfeylqsfledyf[0445]src酪氨酸激酶结构域(seq id no:19)[0446]lrlevklgqgcfgevwmgtwngttrvaiktlkpgtmspeaflqeaqvmkklrheklvqlyavvseepiyivteymskgslldflkgetgkylrlpqlvdmaaqiasgmayvermnyvhrdlraanilvgenlvckvadfglarliedneytarqgakfpikwtapeaalygrftiksdvwsfgilltelttkgrvpypgmvnrevldqvergyrmpcppecpeslhdlmcqcwrkepeerptfeylqafledyf[0447]lck酪氨酸激酶结构域(seq id no:20)[0448]lklverlgagqfgevwmgyynghtkvavkslkqgsmspdaflaeanlmkqlqhqrlvrlyavvtqepiyiiteymengslvdflktpsgikltinklldmaaqiaegmafieernyihrdlraanilvsdtlsckiadfglarliedneytaregakfpikwtapeainygtftiksdvwsfgillteivthgripypgmtnpeviqnlergyrmvrpdncpeelyqlmrlcwkerpedrptfdylrsvledff[0449]lck_y505f酪氨酸激酶结构域(seq id no:21)[0450]lklverlgagqfgevwmgyynghtkvavrslkqgsmspdaflaeanlmkqlqhqrlvrlyavvtqepiyiiteymengslvdflktpsgikltinklldmaaqiaegmafieernyihrdlraanilvsdtlsckiadfglarliedneytaregakfpikwtapeainygtftiksdvwsfgillteivthgripypgmtnpeviqnlergyrmvrpdncpeelyqlmrlcwkerpedrptfdylrsvledff[0451]能够间接磷酸化itam的活性调节剂可以包括cd4或cd8共受体的胞内结构域。[0452]如上所述，在t细胞活化过程中，cd3(或car)的itam被lck磷酸化，然后与zap70结合。在zap70与cd3结合后，共受体cd4或cd8与tcr/cd3复合物相结合，并与主要组织相容性复合体结合(mhc)。cd4/cd8共受体与所述复合物的结合稳定了tcr‑mhc肽(mhcp)的相互作用，且招募的/游离的lck继续磷酸化cd3件、zap70以及许多其它下游靶标。[0453]包含cd4和cd8的胞质尾的活性调节剂将通过招募lck来扩展car产生的信号，lck对于激活活化的t细胞的信号传导级联的许多分子成分是必不可少的。人cd4和cd8胞内结构域的序列如下文seq id no.22和23所示。[0454]cd4的胞质尾(seq id no:22)[0455]cvrcrhrrrqaermsqikrllsekktcqcphrfqktcspi[0456]cd8的胞质尾(seq id no:23)[0457]lycnhrnrrrvckcprpvvksgdkpslsaryv[0458]调节car活性的活性调节剂可以是膜栓系的。在这方面，此类活性调节剂可以包含跨膜结构域或肉豆蔻酰化序列。[0459]调节car‑t细胞的活性[0460]1.检查点抑制[0461]能够调节car表达细胞的活性的活性调节剂可以阻断或降低由抑制性免疫受体(如ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla 1)介导的对car介导的t细胞活化的抑制(如上所述并在图2b中示意性示出)。[0462]活性调节剂可以是与抑制性免疫受体结合或与抑制性免疫受体的配体结合的试剂，如抗体。活性调节剂可以与ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla 1结合，或与ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla 1的配体结合。[0463]pd‑1/pd‑l1[0464]在癌症状态下，如上所述，肿瘤细胞上的pd‑l1与t细胞上的pd‑1的相互作用减少了t细胞的活化，从而使得免疫系统攻击肿瘤细胞备受阻碍。使用阻断pd‑l1与pd‑1受体相互作用的抑制剂可以防止癌症以这种方式逃避免疫系统。临床上正在试用几种pd‑1和pd‑l1抑制剂以用于晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤，以及其它癌症类型。一些这样的抑制剂现在已获得批准，包括pd1抑制剂纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)以及pd‑l1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和度伐鲁单抗(durvalumab)。[0465]ctla4[0466]ctla4是免疫球蛋白超家族的成员，其由活化的t细胞表达并向t细胞传递抑制性信号。ctla4与t细胞共刺激蛋白cd28同源，并且这两个分子都与抗原提呈细胞上的cd80和cd86(也分别称为b7‑1和b7‑2)结合。相比于cd28，ctla‑4以更大的亲和力和亲和性与cd80和cd86结合，从而使其能够超越cd28竞争其配体。ctla4向t细胞传递抑制性信号，而cd28则传递刺激性信号。[0467]针对ctla4的拮抗抗体包括伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)。[0468]lag‑3[0469]淋巴细胞激活基因3，也称为lag‑3和cd223，是一种免疫检查点受体，其对t细胞功能具有多种生物学影响。[0470]lag3的抗体包括relatlimab，其目前处于1期临床测试中，其它许多处于临床前开发中。lag‑3可能是比ctla‑4或pd‑1更好的检查点抑制剂靶标，因为针对后两个的抗体仅激活效应t细胞，但不抑制treg活性，而拮抗剂lag‑3抗体既可以激活t效应细胞(通过将lag‑3抑制信号下调为预激活的lag‑3+细胞)，又可以抑制所诱导的(即抗原特异性的)treg抑制活性。涉及lag‑3抗体和ctla‑4或pd‑1抗体的联合疗法也在进行中。[0471]1.2显性负性shp[0472]阻断或减少抑制性免疫受体(例如ctla4、pd‑1、lag‑3、2b4或btla1)所介导的抑制作用的活性调节剂可能会打破t细胞：靶细胞突触的磷酸化和去磷酸化之间的平衡，有利于itam的磷酸化，从而导致t细胞活化。例如，活性调节剂通过蛋白质(例如shp‑1和shp‑2)可以阻断或减少抑制性受体胞内域中itim的磷酸化，或者可以阻断或减少car信号传导结构域中itam的去磷酸化。[0473]wo2016/193696描述了能够调节t细胞:靶细胞突触的磷酸化:去磷酸化平衡的各种不同类型的蛋白质。例如，活性调节剂可以包含shp‑1或shp‑2的截短形式，其包含一个或两个sh2结构域，但缺乏磷酸酶结构域。当在car‑t细胞中表达时，这些分子充当野生型shp‑1和shp‑2的显性负性版本，并与内源性分子竞争与磷酸化的itim的结合。[0474]活性调节剂可以是截短的蛋白质，其包含sh2结构域但但缺乏磷酸酶结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的酪氨酸免疫受体抑制基序(itim)结合的蛋白质。截短的蛋白质可以包含一个或两个shp‑1 sh2结构域，但缺乏shp‑1磷酸酶结构域。或者，截短的蛋白质可以包含一个或两个shp‑2 sh2结构域，但缺乏shp‑2磷酸酶结构域。[0475]shp‑1[0476]包含src同源区2结构域的磷酸酶‑1(shp‑1)是蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的成员。也称为ptpn6。[0477]shp‑1的n端区域包含两个串联的sh2结构域，它们介导shp‑1与其底物的相互作用。c端区域包含酪氨酸蛋白磷酸酶结构域。[0478]shp‑1能够与许多抑制性免疫受体或含itim的受体结合并传播信号。此类受体的实例包括但不限于pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1和kir3dl3。[0479]人shp‑1蛋白具有uniprotkb登录号p29350。[0480]活性调节剂可以包含以下seq id no:24所示的shp‑1串联sh2结构域或由以下seq id no:24所示的shp‑1串联sh2结构域组成。[0481]shp‑1 sh2完整结构域(seq id no:24)[0482]mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytsigusoftqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyy[0483]shp‑1在序列的n端具有两个sh2结构域，位于残基4‑100和110‑213处。活性调节剂可以包含seq id no.25和26所示的序列中的一种或两种。[0484]shp‑1sh2 1(seq id no:25)[0485]wfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytsigusoftqgvlqdrdgtiihlkypl[0486]shp‑2sh2 2(seq id no.26)[0487]wyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy[0488]活性调节剂可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的seq id no:24、25或26的变体，只要所述变体序列是具有所需性质的sh2结构域序列。换言之，变体序列应当能够与允许招募shp‑1的pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3中的至少一个的胞质尾中的磷酸化酪氨酸残基结合。[0489]shp‑2[0490]shp‑2，也称为ptpn11，ptp‑1d和ptp‑2c，其是蛋白质酪氨酸磷酸酶(ptp)家族的成员。与ptpn6一样，shp‑2具有结构域结构，其由其n端的两个串联sh2结构域后接蛋白质酪氨酸磷酸酶(ptp)结构域组成。在失活状态下，n端sh2结构域结合ptp结构域并阻断潜在底物进入活性位点。因此，shp‑2是自抑制的。与目标磷酸酪氨酸残基结合后，n端sh2结构域从ptp结构域释放出来，通过减轻自身抑制作用催化激活酶。[0491]人shp‑2具有uniprotkb登录号p35235‑1。[0492]活性调节剂可以包含如以下seq id no:29所示的shp‑1串联sh2结构域或由如以下seq id no:29所示的shp‑1串联sh2结构域组成。shp‑1在序列的n端具有两个sh2结构域，位于残基6‑102和112‑216处。活性调节剂可包含seq id no.27和28所示的序列中的一种或两种。[0493]shp‑2第一sh2结构域(seq id no:27)[0494]wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkypl[0495]shp‑2第二sh2结构域(seq id no.28)[0496]wfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqpl[0497]shp‑2两个sh2结构域(seq id no.29)[0498]wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqpl[0499]活性调节剂可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的seq id no:27、28或29的变体，只要所述变体序列是具有所需性质的sh2结构域序列。换言之，变体序列应当能够与允许招募shp‑2的pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3中的至少一个的胞质尾部中的磷酸化酪氨酸残基结合。[0500]3.细胞因子和细胞因子信号传导[0501]活性调节剂可以是细胞因子或趋化因子。细胞因子可以调节car表达细胞的活性和/或调节肿瘤微环境。[0502]活性调节剂可以是选自下列的细胞因子或趋化因子：il12、flexiil12、gm‑csf、il7、il15、il21、il2和ccl19。特别地，试剂可以是il‑7或il‑12。[0503]il‑7是对b和t细胞发育都重要的细胞因子。il‑7刺激多能造血干细胞分化为淋巴祖细胞，并刺激淋巴谱系中所有细胞(b细胞，t细胞和nk细胞)的增殖。[0504]il‑7和肝细胞生长因子(hgf)形成异二聚体，其用作前祖b细胞(pre‑pro‑b cell)生长刺激因子。据发现该细胞因子是t细胞早期发育过程中t细胞受体beta(tcrβ)的v(d)j重排的辅助因子。人il‑7的氨基酸序列可从uniprot获得(登录号p13232)。[0505]白介素12(il‑12)是一种有效的免疫调节细胞因子，其对调节肿瘤微环境从而重新定向对癌症的免疫应答具有特别重要的意义。il‑12具有系统性毒性，因此局部产生il‑12的方法受到。pct/gb2018/052204描述了一种构建体，其中在启动子的控制下产生免疫调节细胞因子(例如il‑12)，所述启动子在环境代谢物(例如犬尿氨酸)的存在下被激活。在代谢物(例如犬尿氨酸)存在下选择性产生il‑12使得仅当代谢物存在于肿瘤微环境中时，car或tcr表达细胞才能够局部产生il‑12。[0506]或者，免疫调节细胞因子可以置于框滑基序(frame‑slip motif)或翻译通读基序的下游。这提供了一种控制细胞因子表达并降低细胞因子相对于car的表达水平的方法。[0507]框滑基序(fsm)可包含尿嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基的重复序列，例如序列uuuuuuu(seq id no.61)。[0508]框滑基序也可以包含终止密码子。例如，fsm可以包含以下序列之一：[0509]uuuuuuuga(seq id no.62)[0510]uuuuuuuag(seq id no.63)[0511]uuuuuuuaa(seq id no.64)。[0512]翻译通读基序(trm)可以包含序列stop‑cuag或stop‑caauua，其中“stop”是终止密码子。例如，翻译通读基序可以包含以下序列之一：[0513]uga‑cuag(seq id no.65)[0514]uag‑cuag(seq id no.66)[0515]uaa‑cuag(seq id no.67)[0516]uga‑caauua(seq id no.68)[0517]uag‑caauua(seq id no.69)[0518]uaa‑caauua(seq id no.70)[0519]il‑12是由两个单独的基因il‑12a(p35)和il‑12b(p40)编码的异二聚体细胞因子。活性异二聚体(称为‘p70’)是在蛋白质合成之后形成的。活性调节剂可以是“flexi‑il12”，它是通过接头连接的il‑12α和il‑12β亚单位之间的融合体。合适的flexi‑il‑12序列如以下seq id no.81所示。[0520]seq id no.81(flexi‑il‑12序列)[0521][0522]在seq id no.81中，丝氨酸‑甘氨酸接头用粗体加下划线表示。[0523]本发明的活性调节剂可以是根据细胞微环境中环境代谢物的存在而选择性表达的细胞因子。所述环境代谢物可以激活芳烃受体(ahr)。环境代谢物可以是色氨酸代谢物，例如犬尿氨酸。[0524]或者，试剂可以影响细胞因子或趋化因子的表达或活性。例如，试剂可以是细胞因子或趋化因子的显性负性形式。显性负性形式可以是例如细胞因子/趋化因子的突变或截短形式，其与受体结合并与野生型细胞因子/趋化因子竞争，但不触发细胞因子/趋化因子信号传导。[0525]例如，试剂可以是细胞因子受体或趋化因子受体的显性负性形式。显性负性形式可以例如为细胞因子/趋化因子受体的突变或截短形式，其与细胞因子结合，从而阻断所述细胞因子与野生型细胞因子/趋化因子受体的结合。[0526]或者，试剂可以是阻断或以其它方式调节细胞因子或趋化因子信号传导途径的抗体或抗体片段。[0527]活性调节剂可以是包含细胞因子受体胞内域的嵌合细胞因子受体。[0528]活性调节剂可以包含免疫抑制性细胞因子(例如il‑4)的胞外域，所述胞外域与来自增强t细胞增殖的细胞因子(例如il‑7)的胞内域融合(leen et al(2014)mol.ther.22:1211‑1220)。[0529]活性调节剂可以是趋化因子，例如ccl19。趋化因子(c‑c基序)配体19(ccl19)是属于cc趋化因子家族的小细胞因子，其也称为ebi1配体趋化因子(elc)和巨噬细胞炎性蛋白‑3‑β(mip‑3‑beta)。ccl19通过结合趋化因子受体ccr7来激发其对靶细胞的作用。它对免疫系统的某些细胞有吸引力，包括树突状细胞和接合抗原的b细胞以及ccr7+中心记忆t细胞。人ccl19的氨基酸序列可从uniprot获得(登录号q99731)。[0530]3.1嵌合细胞因子受体[0531]或者，所述活性调节剂可以包含非细胞因子受体胞外域。wo2017/029512描述了嵌合细胞因子受体(ccr)，其包含：胞外域，所述胞外域与选自肿瘤分泌因子、趋化因子和细胞表面抗原的配体结合；以及细胞因子受体胞内域。[0532]嵌合细胞因子受体可包含如下两种多肽：[0533](i)第一多肽，其包含：[0534](a)结合配体第一表位的第一抗原结合结构域[0535](b)细胞因子受体胞内域的第一链；和[0536](ii)第二多肽，其包含：[0537](a)结合配体的第二表位的第二抗原结合结构域[0538](b)细胞因子受体胞内域的第二链。[0539]或者，嵌合细胞因子受体包含如下两种多肽：[0540](i)第一多肽，其包含：[0541](a)重链可变结构域(vh)[0542](b)细胞因子受体胞内域的第一链；和[0543](ii)第二多肽，其包含：[0544](a)轻链可变结构域(vl)[0545](b)细胞因子受体胞内域的第二链。[0546]例如，细胞因子受体胞内域可以包含：[0547](i)il‑2受体β链胞内域；[0548](ii)il‑7受体α‑链胞内域；[0549](iii)il‑15受体α‑链胞内域；或[0550](iv)共同γ链受体胞内域。[0551]细胞因子受体胞内域可以包含(i)、(ii)或(iii)；和(iv)。[0552]细胞因子受体胞内域可以包含来自粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子受体(gmcsf‑r)的α链胞内域和β链胞内域。[0553]配体可以是肿瘤分泌因子，例如选自以下的肿瘤分泌因子：前列腺特异性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、血管内皮生长因子(vegf)和ca125。[0554]配体可以是趋化因子，例如选自如下的趋化因子：cxcl12、ccl2、ccl4、ccl5和ccl22。[0555]配体可以是细胞表面分子，例如跨膜蛋白。配体可以是例如cd22。[0556]组成型活性嵌合细胞因子受体[0557]活性调节剂可以是组成型活性嵌合细胞因子受体。活性调节剂可以包含两条链，它们自发地二聚化或在使两个细胞因子受体胞内域聚集在一起的试剂(二聚化的化学诱导剂或cid)存在下二聚化。[0558]因此，活性调节剂可以包含二聚化结构域；和细胞因子受体胞内域。[0559]二聚化可自发发生，在该情况下，嵌合跨膜蛋白将具有组成型活性。或者，二聚化可能仅在存在二聚化化学诱导剂(cid)的情况下发生，在该情况下，跨膜蛋白仅在cid的存在下引起细胞因子型信号传导。[0560]适合的二聚化结构域和cid在wo2015/150771中有描述，其内容通过引用的方式并入本文中。[0561]例如，一个二聚化结构域可以包含fk结合物12(fkbp12)的雷帕霉素结合结构域，另一个二聚化结构域可以包含mtor的fkbp12‑雷帕霉素结合(frb)结构域；且cid可以是雷帕霉素或其衍生物。[0562]一个二聚化结构域可以包含fk结合物12(fkbp12)的fk506(tacrolimus)结合结构域，另一个二聚化结构域可以包含环孢菌素a的环孢菌素结合结构域；且cid可以是fk506/环孢菌素融合体或其衍生物。[0563]一个二聚化结构域可以包含雌激素结合结构域(ebd)，且另一个二聚化结构域可以包含链霉抗生物素蛋白结合结构域；且cid可以是雌酮/生物素融合蛋白或其衍生物。[0564]一个二聚化结构域可以包含糖皮质激素结合结构域(gbd)，另一个二聚化结构域可以包含二氢叶酸还原酶(dhfr)结合结构域；且cid可以是地塞米松/甲氨蝶呤融合蛋白或其衍生物。[0565]一个二聚化结构域可以包含o6‑烷基鸟嘌呤‑dna烷基转移酶(agt)结合结构域，另一个二聚化结构域可以包含二氢叶酸还原酶(dhfr)结合结构域；且cid可以是o6‑苄基鸟嘌呤衍生物/甲氨蝶呤融合蛋白或其衍生物。[0566]一个二聚化结构域可以包含视黄酸受体结构域，另一个二聚化结构域可以包含蜕皮激素受体结构域；且cid可以是rsl1或其衍生物。[0567]在二聚化结构域自发异质二聚化的情况下，其可以基于抗体的二聚化结构域。特别地，其可以包含重链恒定结构域(ch)和轻链恒定结构域(cl)的二聚化部分。恒定结构域的“二聚化部分”是形成链间二硫键的序列的一部分。[0568]嵌合细胞因子受体可以包含抗体的fab部分作为胞外域。在这方面，嵌合抗原可包含两种多肽:[0569](i)第一多肽，其包含：[0570](a)重链恒定结构域(ch)[0571](b)细胞因子受体胞内域的第一链；和[0572](ii)第二多肽，其包含：[0573](a)轻链恒定域(cl)[0574](b)细胞因子受体胞内域的第二链。[0575]细胞因子受体胞内域可以包含：[0576](i)il‑2受体β链胞内域[0577](ii)il‑7受体α链胞内域；或[0578](iii)il‑15受体α链胞内域；和/或[0579](iv)共同γ链受体胞内域。[0580]细胞因子受体胞内域可以包括来自粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子受体(gmcsf‑r)的α链胞内域和β链胞内域。[0581]具有il‑2、il‑7或gm‑csf受体胞内域的组成型活性ccr可以具有以下结构之一：[0582]fab_ccr_il2：[0583]hulightkappa‑il2rgtm‑il2rgendo‑2a‑huch1‑il2btm‑il2rbendo[0584]fab_ccr_il7：[0585]hulightkappa‑il2rgtm‑il2rgendo‑2a‑huch1‑il7ratm‑il7raendofab_ccr_gmcsf:[0586]hulightkappa‑gmcsfrbtm‑gmcsfrbendo‑2a‑huch1‑gmcsfratm‑gmcsfraendo[0587]其中：[0588]hulightkappa是人kappa轻链[0589]il2rgtm是来自人il2r共同γ链的跨膜结构域[0590]il2rgendo是源自人il2r共同γ链的胞内域[0591]2a是能够使两种多肽共分离的序列，其可以是自切割肽，例如2a肽[0592]huch1是人ch1[0593]il2btm是来自人il‑2rβ的跨膜结构域[0594]il2rbendo是来自人il2rβ的胞内域[0595]il7ratm是来自人il‑7rα的跨膜结构域[0596]il7raendo是来自人il‑7rα的胞内域[0597]gmcsfrbtm是来自人gm‑csfr共同β链的跨膜结构域[0598]gmcsfrbendo是来自gm‑csfr共同β链的胞内域[0599]gmcsfratm是来自人gf‑csfrα的跨膜结构域[0600]gmcsfraendo是源自人gm‑csfrα的胞内域[0601]用于制备组成型活性细胞因子受体的组分的序列如以下seq id no.30‑43所示。[0602]seq id no.30(人kappa轻链)[0603]rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0604]seq id no.31(人铰链)[0605]epkscdkthtcppcpkdpk[0606]seq id no.32(人ch1)[0607]stkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv[0608]seq id no.33(来自人il2r共同γ链的跨膜结构域)：[0609]vvisvgsmgliisllcvyfwl[0610]seq id no.34(来自人il‑2rβ的跨膜结构域)[0611]ipwlghllvglsgafgfiilvylli[0612]seq id no.36(来自人il‑7rα的跨膜结构域)[0613]pilltisilsffsvallvilacvlw[0614]seq id no.37(来自人gf‑csfrα的跨膜结构域)[0615]nlgsvyiyvllivgtlvcgivlgflf[0616]seq id no.38(来自人gm‑csfr共同β链的跨膜结构域)[0617]vlalivifltiavllal[0618]seq id no.39(来自人il2r共同γ链的胞内域)[0619]ertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseippkggalgegpgaspcnqhspywappcytlkpet[0620]seq id no.40(来自人il‑2rβ的胞内域)[0621]ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllsigusoftdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsgeddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv[0622]seq id no.41(来自人il‑7rα的胞内域)[0623]kkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpsigusoftleesekqrlggdvqspncpsedvvitpesfgrdssltclagnvsacdapilsssrsldcresgkngphvyqdlllslgttnstlpppfslqsgiltlnpvaqgqpiltslgsnqeeayvtmssfyqneq[0624]seq id no.42(源自人gm‑csfrα的胞内域)[0625]krflriqrlfppvpqikdklndnhevedeiiweeftpeegkgyreevltvkeit[0626]seq id no.43(来自gm‑csfr共同β链的胞内域)[0627]rfcgiygyrlrrkweekipnpskshlfqngsaelwppgsmsaftsgspphqgpwgsrfpelegvfpvgfgdsevspltiedpkhvcdppsgpdttpaasdlpteqppspqpgppaashtpekqassfdfngpylgpphsrslpdilgqpeppqeggsqkspppgsleylclpaggqvqlvplaqamgpgqaveverrpsqgaagspslesgggpappalgprvggqdqkdspvaipmssgdtedpgvasgyvssadlvftpnsgassvslvpslglpsdqtpslcpglasgppgapgpvksgfegyvelppiegrsprsprnnpvppeakspvlnpgerpadvsptspqpegllvlsigusoftvgdycflpglgpgplslrskpsspgpgpeiknldqafqvkkppgqavpqvpviqlfkalksigusoftdylslppwevnkpgevc[0628]活性调节剂可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的seq id no:30至43中的一个或多个的变体，只要所述变体序列具有所需的性质。例如，变体ch或cl序列应保持与包含cl/ch的链二聚化的能力。当与细胞因子受体的交互链结合时，来自细胞因子受体胞内域的变体链应保持触发细胞因子介导的信号传导的能力。[0629]3.3jak/stat[0630]信号转导和转录激活因子(stat)分子是参与细胞因子介导的信号转导的转录因子家族。stat转录因子被招募到细胞表面受体的胞质区，并通过磷酸化激活。一旦被激活，它们二聚化形成包含第一多肽和第二多肽的活化的stat分子，并移位到细胞核内，在那里它们影响着基因表达。它们在调节细胞生长过程和细胞分化中起一定的作用。jak‑stat信号通路由三个主要成分组成：(1)穿透细胞膜的受体；(2)janus激酶(jak)，其与受体结合；(3)信号转导和转录激活因子(stat)，其将信号带入细胞核和dna(见图3)。[0631]通过在细胞中包含组成型活性或诱导型活性jak或stat分子，可以增强car表达细胞的移植成活和持久性。国际专利申请案pct/gb2018/052583描述了组成型活性stat分子(国际专利申请案pct/gb2018/052583中的图4)和诱导型stat分子(国际专利申请案pct/gb2018/052583中的图5)的各种替代布置。[0632]如国际专利申请pct/gb2018/052583中所述，组成型活性jak分子可以通过表达两个jak多肽来制备，所述两个jak多肽自发二聚或通过接头连接，如下文对组成型活性stat分子描述的那样。或者，可以表达包含功能增益(gain‑of‑function)突变的组成型活性jak。[0633]活性调节剂可以是组成型活性或诱导型的信号转导子和转录激活因子(stat)分子。[0634]细胞的stat分子可以是包含第一二聚结构域(dd)的第一stat多肽和包含第二dd的第二stat多肽，所述第二dd与所述第一dd结合。[0635]细胞的stat分子的第一dd和第二dd可以例如包含亮氨酸拉链结构域；或重链恒定区和轻链恒定区。[0636]细胞的诱导型stat分子可以在试剂的存在下具有可诱导的活性，所述试剂引起stat分子的第一dd和第二dd的二聚化，从而诱导stat分子的活化。例如，第一dd可以包括frb，第二dd可以包括fkbp12，且所述试剂可以是雷帕霉素。[0637]或者，细胞的stat分子可以在试剂的存在下诱导失活，所述试剂引起所述stat分子的第一dd和第二dd解离，从而诱导stat分子的失活。所述第一dd可以包括tetrb，所述第二dd可以包括tip，且所述试剂可以是四环素、强力霉素或米诺环素。[0638]组成型活性stat可以包括功能增益(gof)突变，或者可以包括通过接头序列连接的第一stat多肽和第二stat多肽。[0639]细胞可以包含膜栓系分子和组成活性stat分子，所述膜栓系分子包含栓系结构域和第一结合结构域(bd)，所述组成型活性stat分子包含与所述第一bd特异性结合的第二bd。所述第一和第二bd的结合可以因试剂的存在而遭到破坏，这样一来，在试剂的存在下，所述组成型活性stat分子与所述膜栓系分子解离，从而使得组成型活性stat分子能够自由地移位到细胞核。[0640]细胞的stat分子的第一和第二dd；或细胞的膜栓系分子的第一bd和细胞的stat分子的第二bd可以分别包含tet阻遏蛋白(tetr)和转录诱导肽(tip)；且所述试剂可以是四环素，强力霉素或米诺环素。[0641]细胞可以包含：a)car和由stat释放结构域连接的组成型活性stat分子；和b)stat释放分子，其仅在识别对所述car有特异性的靶抗原时才在stat释放结构域从car释放所述组成型活性stat分子，从而使得在释放后，组成型活性stat分子可以自由地移位到核。[0642]stat释放分子可以包含car靶向结构域，所述car靶向结构域例如与磷酸化的免疫受体酪氨酸激活基序(itam)结合。例如，car靶向结构域可以包括一个或多个zap70 sh2结构域。[0643]本发明的细胞的stat释放结构域可以包含蛋白酶切割位点，并且细胞的stat释放分子可以包含蛋白酶结构域，使得在识别car的靶抗原后，蛋白酶结构域在蛋白酶切割位点切割，从而释放stat分子。[0644]4.黏附分子[0645]细胞黏附分子(cam)是位于细胞表面的蛋白质，其参与与其它细胞的结合或与细胞黏附中的细胞外基质(ecm)的结合。[0646]这些蛋白质通常是跨膜受体，且由以下三个结构域组成：与细胞骨架相互作用的胞内域，跨膜结构域，以及胞外域，所述胞外域与同类的其它cam相互作用(同质结合)或与其它cam或细胞外基质相互作用(异质结合)。[0647]大多数cam属于四个蛋白质家族：ig(免疫球蛋白)超家族(igsf cam)、整合蛋白、钙粘蛋白和选择蛋白。[0648]本发明的活性调节剂可以是调节car活性或tcr表达细胞活性的黏附分子或包含调节car活性或tcr表达细胞活性的黏附分子。[0649]5.转录因子[0650]本发明的试剂可以是调节car或tcr表达细胞的活性的转录因子或包含调节car或tcr表达细胞的活性的转录因子。[0651]转录因子是一种蛋白质，它通过与特异性dna序列结合来控制从dna到信使rna的遗传信息的转录速率，并调节包含所述序列或与所述序列相邻的基因的表达。[0652]转录因子通过促进(作为活化剂)或阻断(作为阻遏物)rna聚合酶的招募而发挥作用。[0653]转录因子包含至少一个dna结合结构域(dbd)，所述结构域附着于dna的增强子或启动子区域中的任何一个。根据转录因子的不同，上调或下调相邻基因的转录。转录因子还包含反式激活结构域(tad)，所述结构域具有针对其它蛋白质(例如转录共调节因子)的结合位点。[0654]转录因子使用多种机制来调节基因表达，包括稳定或阻断rna聚合酶与dna的结合，或催化组蛋白的乙酰化或脱乙酰化。转录因子可以具有组蛋白乙酰转移酶(hat)活性，所述活性使组蛋白乙酰化，削弱了dna与组蛋白的结合，并使dna更易于转录，从而上调转录。或者，转录因子可以具有组蛋白去乙酰化酶(hdac)活性，所述活性使组蛋白去乙酰化，增强了dna与组蛋白的结合，并使dna不易转录，从而下调转录。它们发挥作用的另一种可能的机制是通过将共活化剂或共加压蛋白招募到转录因子dna复合物中。[0655]转录可以是组成型活性或条件型活性的，即需要激活。[0656]转录因子可以是天然存在的或人工的。[0657]5.1转录重编程[0658]为了使car‑t细胞有效，重要的是其必须在体内持续存在且扩增，并对抗过度快速的分化和耗竭。car‑t细胞的持久性和移植成活与施用的天然t细胞、中心记忆t细胞和t干细胞记忆t细胞的比例有关。[0659]wo2018/115865描述了共表达嵌合抗原受体(car)和转录因子的细胞。转录因子的表达可以阻止或减少细胞在体外和/或体内的分化和/或耗竭。通过在细胞中与转录因子共表达car，有可能阻止或减少细胞的分化和/或耗竭。这导致在免疫疗法用的细胞组合物中具有更大比例的天然细胞，中心记忆细胞和干细胞记忆细胞，并且导致细胞在体内更有效的持久性和扩增。[0660]本发明的活性调节剂可以是转录因子。转录因子可以阻止或减少细胞的分化和/或耗竭。[0661]转录因子可以是效应子记忆阻遏物，例如blimp‑1。[0662]或者，转录因子可以是中心记忆阻遏物，例如bcl6或bach2。[0663]转录因子可以是bach2或bach2的修饰形式或包含bach2或bach2的修饰形式，所述修饰形式已降低或去除通过alk磷酸化的能力。例如，修饰的bach2可以在以下一个或多个位置处包含突变：ser‑535、ser‑509、ser‑520。[0664]转录因子可以是foxo1、eomes、runx3或cbfβ。[0665]6.调节tgfβ信号传导[0666]工程化细胞面临不利的微环境，从而限制了过继性免疫疗法。肿瘤微环境中的主要抑制机制之一是转化生长因子beta(tgfβ)。tgfβ信号传导通路在控制各种细胞过程的信号调控中发挥关键作用。tgfβ在t细胞自稳和细胞功能控制中也起到核心作用。特别是，tgfβ信号传导与t细胞的免疫抑制状态有关，伴有减少增殖和活化。tgfβ表达与肿瘤的免疫抑制微环境有关。[0667]已知多种癌性肿瘤细胞直接产生tgfβ。除了癌细胞产生tgfβ外，tgfβ还可以由肿瘤部位存在的多种非癌细胞产生，例如肿瘤相关的t细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、上皮细胞和基质细胞。[0668]转化生长因子β受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体的超家族。这些受体与生长因子和细胞因子信号传导蛋白的tgfβ超家族的成员结合。存在五种ii型受体(激活受体)和七种i型受体(信号传导传播受体)。[0669]还存在辅助共受体(也称为iii型受体)。配体的tgfβ超家族的每个亚家族均与i型和ii型受体结合。[0670]三种转化生长因子具有很多活性。tgfβ1和2与癌症有关，其中它们可能刺激癌症干细胞，增加纤维化/促纤维增生反应并抑制肿瘤的免疫识别。[0671]tgfβ1、2和3经由与受体tβrii结合、然后与tβri缔合进行信号传导，且在为tgfβ2的情况下还与tβriii缔合。这导致随后经由tβri通过smad进行信号传导。[0672]tgfβ通常在前祖(pre‑pro)形式中分泌。“pre”是n端信号肽，其在进入内质网(er)时被裂解。“pro”在er中被裂解，但保持共价连接，并在tgfβ周围形成一个笼子，称为潜伏期相关肽(lap)。所述笼子会响应各种蛋白酶(包括凝血酶和金属蛋白酶等)而打开。c端区域通过蛋白水解裂解从前体区释放后成为成熟的tgfβ分子。成熟的tgfβ蛋白二聚化生成活性同源二聚体。[0673]tgfβ同源二聚体与衍生自tgfβ基因产物n端区域的lap相互作用，形成称为小潜在复合物(slc)的复合物。所述复合物保留在细胞中，直至被另一种蛋白质结合，此类蛋白质是一种称为潜在tgfβ结合物(ltbp)的细胞外基质(ecm)蛋白，它们一起形成了一种称为大潜在复合物(llc)的复合物。lcc分泌于ecm上。tgfβ通过几种类型的蛋白酶(包括金属蛋白酶和凝血酶)从该复合物释放为生物活性形式。[0674]本发明的活性调节剂可以调节tgfβ信号传导。[0675]例如，活性调节剂可以阻断或减少tgfβ与tgfβ受体的结合；它可与tgfβ或tgfβr竞争与tgfβr或tgfβ的结合；或者，它可以例如经由smad调节下游的tgfβ信号传导。[0676]活性调节剂可以是一种试剂，例如结合tgfβ或tgfβ受体的抗体。[0677]fresolimumab是阻断tgfβ1‑3的免疫调节抗体。已在转移性黑色素瘤和高级别神经胶质瘤中对fresolimumab进行了测试。其表明在增强肿瘤特异性免疫应答方面有一些效果，但未能根除肿瘤。其它结合tgfβ的抗体包括lerdelimumab和metelimumab。[0678]bedinger et al(2016)描述了各种中和多个tgfβ同种型的人单克隆抗体(mabs 8(2):389–404)。[0679]或者，活性调节剂可以是包含tβrii(tβrii‑fc)或iii型受体(β聚糖)的可溶性胞外域的重组fc融合蛋白。可溶性tβrii和可溶性tβriii(β聚糖)充当诱饵受体，以防止与tgf‑β的结合。[0680]6.1显性负性tgfβ[0681]活性调节剂可以是分泌因子，其能够结合转化生长因子β受体(tβr)并破坏所述受体与转化生长因子beta(tgfβ)的相互作用。[0682]活性调节剂可以是显性负性tgfβ。[0683]如本文使用的“显性负性tgfβ”或dntgfβ是指分泌因子tgfβ对野生型tgfβ具有拮抗作用。[0684]显性负性tgfβ抑制野生型tgfβ诱导的信号传导，从而中和其生物学效应。[0685]活性调节剂可以是突变体tgfβ。[0686]野生型tgfβ2的成熟蛋白如以下seq id no:44中所示。[0687]aldaaycfrnvqdncclrplyidfkrdlgwkwihepkgynanfcagacpylwssdtqhsrvlslyntinpeasaspccvsqdlepltilyyigktpkieqlsnmivksckcs(seq id no:44)。[0688]当通过与seq id no:44比对确定氨基酸数目时，突变体tgfβ可以包含在氨基酸残基w30、w32、l101、l51、q67和y6处的一个或多个突变，并且其中：[0689]氨基酸残基30突变为n、r、k、d、q、l、s、p、v、i、g、c、t、a或e；和/或[0690]氨基酸残基32突变为a；和/或[0691]氨基酸残基101突变为a、e；和/或[0692]氨基酸残基51突变为q、w、y、a；和/或[0693]氨基酸残基67突变为h、f、y、w、y；和/或[0694]氨基酸残基6突变为a或其变体。[0695]或者，活性调节剂可以包含截短的多肽，例如单体tgfβ。kim et al(2017)描述了一种工程化tgfβ单体，其具有阻断tgfβ信号传导的显性负性作用(j.biol.chem.doi:10.1074/jbc.m116.768754)。[0696]截短的tgfβ可能缺乏跟部α3螺旋，这是结合tgfβi型受体(tβri)必不可少的结构基序，但对于结合tβrii而言可有可无。[0697]tgfβ单体的氨基酸序列如seq id no:45中所示。seq id no:45包含信号肽和潜伏期相关肽(lap)。[0698]mhycvlsaflilhlvtvalslstcstldmdqfmrkrieairgqilsklkltsppedypepeevppevisiynstrdllqekasrraaacerersdeeyyakevykidmppffpsenaipptfyrpyfrivrfdvsameknasnlvkaefrvfrlqnpkarvpeqrielyqilkskdltsptqryidskvvktraegewlsfdvtdavhewlhhkdrnlgfkislhcpcctfvpsnnyiipnkseelearfagidgtstytsgdqktikstrkknsgktphlllmllpsyrlessigusofttnrrkkraldaaycfrnvqdncclrplyidfrkdlgwkwihepkgynanfcagacpyraskspscvsqdlepltivyyvgrkpkveqlsnmivksckcs(seq id no:45)。[0699]活性调节剂可以具有seq id no:45或其变体中所示的氨基酸序列。变体tgfβ单体可以与seq id no:45具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，只要所述多肽提供能够结合转化生长因子β受体(tβr)并破坏tβr与转化生长因子β(tgfβ)相互作用的单体。[0700]6.2显性负性tgfβ受体[0701]活性tgfβ受体(tβr)是一种异四聚体，其由两个tgfβ受体i(tβri)和两个tgfβ受体ii(tβrii)组成。tgfβi以潜伏形式分泌，并通过多种机制激活。一旦被激活，它就会与tβrii、tβri形成复合物，从而磷酸化并激活tβri。[0702]活性调节剂可以是显性负性tgfβ受体。显性负性tgfβ受体可能缺乏激酶结构域。[0703]例如，活性调节剂可以包含seq id no.46所示的序列或由seq id no.46所示的序列组成，其为tgf受体ii的单体形式。[0704]seq id no.46(dn tgfβrii)[0705]tipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrsigusoftklss[0706]据报道，显性负性tgf‑βrii(dntgf‑βrii)可以增强在侵袭性人前列腺癌小鼠模型中靶向psma的car‑t细胞的增殖、细胞因子分泌、耐耗竭性、体内长期持久性，以及诱导肿瘤根除(kloss et al(2018)mol.ther.26:1855‑1866)。[0707]6.3smad[0708]如上所述，活性tgfβ受体(tβr)是一种异四聚体，其由两个tgfβ受体i(tβri)和两个tgfβ受体ii(tβrii)组成。当活化的tgf‑β以高亲和力结合转化生长因子‑β受体‑2(tβrii)时，启动信号传导。这种结合需要转化生长因子‑β受体‑3(tβriii)(也称为β聚糖)的参与，其导致tβrii的构型改变，从而促进配体‑受体结合tgf‑β受体‑1/alk‑5(tβri)(丝氨酸/苏氨酸激酶)，其随后被招募到tgf‑β/tβrii复合物中，并通过磷酸化smad2和smad3来启动信号传导，所述smad2和smad3属于smad蛋白受体调节家族。磷酸化的smad2和smad3与smad4结合形成异聚复合物，所述复合物移位至细胞核，以与各种转录因子相互作用，最终导致细胞反应。[0709]smad蛋白是细胞内转录因子，其用于在tgfβ激活后将细胞外信号从膜传递到核。已经识别了三种类型的smad：包括smad2和smad3的受体调节的smad(r‑smad)和仅包括smad4的公共介体性smad(co‑smad)，最后，包括smad 6和smad 7的抑制性smad(i‑smad)。[0710]smad蛋白由通过接头区域连接的两个球形结构域组成。smad的n端结构域或“mad同源1”(mh1)结构域的主要功能是结合dna。c端结构域或mh2结构域介导大量调节因子与效应蛋白的蛋白质之间的相互作用，包括tβr受体，某些细胞质锚定蛋白，谱系特异性dna结合辅因子和染色质修饰剂。在tgfβ存在下，r‑smad被tgfβ受体磷酸化。此类磷酸化靶向smad的c端序列中的两个丝氨酸残基pser‑x‑pser，形成酸性尾端，从而驱动smad转录复合物的形成。在大肠癌患者中，已识别出mh2结构域n端部分中两个保守的氨基酸的错义突变。这两个突变会导致获得显性负性行为，从而抵消wt smad蛋白的活性。[0711]活性调节剂可以是smad信号传导抑制剂，例如galunisertib，其已作为单一疗法进行了测试或与用于治疗胶质母细胞瘤的烷基化试剂洛莫司汀(lomustine)或替莫唑胺(temozolamide)以及其它组合联合进行了测试。[0712]或者，活性调节剂可以是仅表达mh2结构域的信号转导的smad2和smad3和smad4的显性负性形式。活动调节剂可以是：i)mh2；ii)截短的mh2，其缺少最后的24aa；以及iii)截短的smad 2_mh2‑linker‑smad 3_mh2。这些显性负性蛋白与野生型smad蛋白竞争受体停靠结构域以及与伴侣蛋白的结合，从而减少或阻断tgfβ信号传导。[0713]dnsmad可以选自smad2、smad3和或smad4中的一个或多个。dnsmad缺乏功能性mh1结构域。[0714]mh1结构域是smad蛋白n端的保守mad同源结构域。mh1结构域能够与dna结合并负调节mh2结构域的功能。[0715]mh2结构域是smad蛋白c端的保守mad同源结构域。mh2结构域包含中心β‑夹心结构，其具有能够结合磷酸丝氨酸残基的保守环‑螺旋。mh2结构域通过调节蛋白和效应蛋白介导蛋白质:蛋白质的相互作用，所述调节蛋白和效应蛋白包括tβr受体、细胞质锚定蛋白、谱系特异性dna结合辅因子和染色质修饰剂。[0716]活性调节剂可以包含来自smad2、smad3和smad4的野生型mh2结构域或由或基本由来自smad2、smad3和smad4的野生型mh2结构域组成。这些mh2结构域的氨基酸序列如以下seq id no.47至49所示。[0717]wcsiayyelnqrvgetfhasqpsltvdgftdpsnserfclgllsnvnrnatvemtrrhigrgvrlyyiggevfaeclsdsaifvqspncnqrygwhpatvckippgcnlkifnnqefaallaqsvnqgfeavyqltrmctirmsfvkgwgaeyrrqtvtstpcwielhlngplqwldkvltqmgspsvrcssms(seq id no:47‑smad2的mh2结构域)[0718]wcsisyyelnqrvgetfhasqpsmtvdgftdpsnserfclgllsnvnrnaaveltrrhigrgvrlyyiggevfaeclsdsaifvqspncnqrygwhpatvckippgcnlkifnnqefaallaqsvnqgfeavyqltrmctirmsfvkgwgaeyrrqtvtstpcwielhlngplqwldkvltqmgspsircssvs(seq id no:48‑smad3的mh2结构域)[0719]wcsiayfemdvqvgetfkvpsscpivtvdgyvdpsggdrfclgqlsnvhrteaierarlhigkgvqleckgegdvwvrclsdhavfvqsyyldreagrapgdavhkiypsayikvfdlrqchrqmsigusoftqaataqaaaaaqaaavagnipgpgsvggiapaislsaaagigvddlrrlcilrmsfvkgwgpdyprqsiketpcwieihlhralqlldevlhtmpiadpqpld(seq id no:49‑smad4的mh2结构域)[0720]活性调节剂可以包含上述mh2结构域之一的截短形式或基本上由其组成，其中从野生型mh2结构域的c端缺失多达24个氨基酸。[0721]活性调节剂可以包含mh2结构域中的突变，从而增加dnsmad对磷酸化dnsmad受体的结合亲和力。活性调节剂可以基本上由或由以下组成：包含突变r497h、k507q和/或r515g的smad4多肽的mh2结构域，其中氨基酸编号对应于seq id no:49中示出的编号；包含突变k378r和/或k314r的smad3的mh2结构域，其中氨基酸编号对应于seq id no:48中示出的编号。[0722]活性调节剂可以是嵌合dnsmad，其包含如上定义的至少两个dnsmad多肽。嵌合dnsmad的dnsmad多肽可以通过接头结构域连接。[0723]包含dnsmad2多肽和dnsmad3多肽的嵌合dnsmad的氨基酸序列如以下seq id no.50所示。[0724]wcsiayyelnqrvgetfhasqpsltvdgftdpsnserfclgllsnvnrnatvemtrrhigrgvrlyyiggevfaeclsdsaifvqspncnqrygwhpatvckippgcnlkifnnqefaallaqsvnqgfeavyqltrmctirmsfvkgwgaeyrrqtvtstpcwielhlngplqwldkvltqmleysgggsgggslewcsisyyelnqrvgetfhasqpsmtvdgftdpsnserfclgllsnvnrnaaveltrrhigrgvrlyyiggevfaeclsdsaifvqspncnqrygwhpatvckippgcnlkifnnqefaallaqsvnqgfeavyqltrmctirmsfvkgwgaeyrrqtvtstpcwielhlngplqwldkvltqm(seq id no:50)[0725]dnsmad或嵌合dnsmad可包含seq id no:47至50所示的序列；或与seq id no:47至50具有至少80％(优选至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％)序列同一性的变体，只要所述变体序列保持与野生型smad蛋白竞争受体‑停靠结构域以及与伴侣蛋白结合的能力，并减少或阻断tgfβ信号传导。[0726]7.代谢酶[0727]活性调节剂可以是代谢酶，例如amp激活蛋白激酶(ampk)或异柠檬酸脱氢酶(idh)。[0728]ampk在细胞能量自稳中发挥作用，主要是在细胞能量较低时激活葡萄糖和脂肪酸的吸收和氧化。[0729]ampk是由α、β和γ亚单位形成的异三聚体蛋白质复合物。这三个亚单位中的每一个在ampk的稳定性和活性中都发挥特定的作用。具体来说，γ亚单位包括四个特定的胱硫醚β合酶(cbs)结构域，使得ampk能够敏感地检测amp:atp比率的变化。所述四个cbs结构域为amp创建了两个结合位点，通常称为bateman结构域。一个amp与bateman结构域的结合协同提高了第二个amp与另一个bateman结构域的结合亲和力。随着amp结合两个bateman结构域，γ亚单位会发生构象变化，从而暴露在α亚单位上存在的催化结构域。在所述催化结构域中，当通过上游ampk激酶(ampkk)在苏氨酸‑172处发生磷酸化时，ampk被激活。α、β和γ亚单位也可以以不同的同种型存在：γ亚单位可以以γ1、γ2或γ3同种型存在；β亚单位可以以β1或β2同种型存在；且α亚单位可以以α1或α2同种型存在。[0730]以下人类基因编码ampk亚单位：[0731]α–prkaa1，prkaa2[0732]β–prkab1，prkab2[0733]γ–prkag1，prkag2，prkag3[0734]活性调节剂可以包括一个或多个ampk亚单位。活性调节剂可以包括ampk的α、β和γ亚单位。[0735]idh催化异柠檬酸的氧化脱羧反应，产生α‑酮戊二酸酯和co2。这是一个两步过程，其包括：先将异柠檬酸(仲醇)氧化为草酰琥珀酸(酮)，然后将β羧基脱羧为酮，形成α‑酮戊二酸。在人体中，idh以三种同种型存在：idh3催化柠檬酸循环的第三步，同时将线粒体中的nad+转化为nadh。同种型idh1和idh2在柠檬酸循环的背景外催化相同的反应，且其使用nadp+而不是nad+作为辅因子。它们位于细胞质以及线粒体和过氧化物酶体上。[0736]活性调节剂可以是ihd1、ihd2或ihd3。人idh1、2和3的氨基酸序列在ncbi数据库中，其登录号如下：cag38738.1(idh1)；np_002159.2(idh2，同种型1)；np_001276839.1(idh2，同种型2；np_001277043.1(idh2，同种型3)；np_689996.4(idh3,同种型1)；np_001274178.1(idh3,同种型2)；np_001339753.1(idh3,同种型3)。[0737]8.共刺激信号[0738]本发明的活性调节剂可以向t细胞提供共刺激信号。[0739]例如，活性调节剂可以是tnf受体、嵌合tnf受体或tnf受体配体。[0740]tnf家族共刺激分子为t细胞在个体发育过程中提供存活和扩增信号。这些tnf受体(tnfr)通过tnf受体相关因子(traf)第二信使发出信号。[0741]tnfrsf9(4‑1bb)、tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)和tnfrsf14(gitr)向t细胞传递存活信号。tnfrsf7(cd27)和tnfrsf14(hvem)通过初始t细胞表达。为了响应抗原刺激，诱导ox40和4‑1bb的表达，已提出这些tnfr是效应t细胞的标记物。尽管cd27和gitr可以由常规t细胞组成性表达，但在t细胞活化后它们的表达也强烈上调，可能与ox40和4‑1bb表达的上调同步。[0742]ox40、4‑1bb和gitr表达的诱导或上调发生在初始t细胞识别抗原和激活后的24小时内，且比通过记忆t细胞要快得多；这些受体的表达可以持续数小时甚至数天。[0743]tnf受体tnfrsf35/死亡受体3(d3r)被tl1a激活，tl1a被炎症组织瞬时上调，且这种相互作用对于建立免疫应答后t细胞活性的晚期阶段似乎很重要。[0744]t细胞不表达cd40，但cd40l和cd40/cd40l对于b细胞的分化和扩增尤为重要。[0745]t细胞不表达tnfrsf11a(rank)，但是rank/rank‑l途径对免疫发育很重要，并且是破骨细胞活性的关键途径，并且在骨转移过程中很活跃。[0746]t细胞不表达tnfrsf12a(fn14)，但tnfrsf12a与其配体tweak一起在受损或发炎的组织和大多数癌症中表达。[0747]8.1嵌合tnf受体[0748]国际专利申请案pct/gb2018/053629描述了嵌合tnf受体，其包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr信号传导结构域。[0749]嵌合tnfr的存在使得对tnfr信号传导的紧密的时间和/或空间控制能够被解偶联，以便为工程化细胞(例如，car‑t细胞)提供改进的存活信号。嵌合的tnfr可以弥补肿瘤微环境中缺乏的完整的生理免疫应答。可以构建嵌合tnfr，以在肿瘤微环境中接合抗原结合结构域，从而诱导所需的共刺激信号。[0750]嵌合tnfr的抗原结合结构域可以包含tnfr的配体结合结构域。例如，抗原结合结构域可以包含d3r、hvem、cd27、cd40、rank或fn14的配体结合结构域。[0751]嵌合tnfr的信号传导结构域可以是激活信号传导结构域，例如能够通过tnfr相关因子(traf)进行信号传导的结构域。例如，激活信号传导结构域可以包含4‑1bb、ox40或gitr胞内域的信号传导部分。[0752]活性调节剂可以是hvem‑41bb嵌合体、cd27‑41bb嵌合体、rank‑41bb嵌合体或fn14‑41bb嵌合体。这些嵌合tnf受体的适合的氨基酸序列的实例如以下seq id no.51至54所示，其中胞外域以正常文本显示，跨膜结构域以粗体显示，41bb胞内域以斜体显示。[0753]seq id no.51(hvem‑41bb)[0754][0755]seq id no.52(cd27‑41bb)[0756][0757]seq id no.53(rank‑41bb)[0758][0759]seq id no.54(fn14‑41bb)[0760][0761]8.2tnf受体配体[0762]tnf相关细胞因子(tnf家族配体)是ii型跨膜蛋白(细胞内n端)，具有较短的胞质尾(长度为15至25个残基)和较大的细胞外区域(约50个氨基酸)，其中含有受体结合位点所在的标志性tnf同源结构域。[0763]表3中提供了tnfr及其配体的汇总。[0764]表3[0765][0766][0767]活性调节剂可以是tnf受体配体或包含tnf受体配体，例如cd40l(cd154)、ox40l(cd134)或41bbl。这些蛋白质的氨基酸序列如以下seq id no.55至57所示。[0768]seq id no.55(cd40l)[0769]mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhrrldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdimlnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgsigusoftsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl[0770]seq id no.56(ox40l)[0771]mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl[0772]seq id no.57(41bbl)[0773]meyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse[0774]嵌合rtk[0775]受体蛋白酪氨酸激酶(rptk)构成了介导胚胎发育、细胞生长、代谢和免疫功能的细胞内信号调节因子家族。rptk在癌症中经常失调，而导致增殖。[0776]car‑t细胞的增殖能力在不同的结合物和结构之间并不一致，赋予最大增殖激励的特征难以捉摸。car‑t细胞暴露于不利的肿瘤微环境中，以二聚体形式掺入rptk可以为car‑t细胞提供增殖优势。能够在不存在同源配体的情况下进行信号传导的rtk的表达打破了剥夺肿瘤免疫的环境，从而改善car‑t细胞存活信号。[0777]rtk通过配体诱导的二聚化/低聚化进行信号传导，从而导致在其胞质尾的激酶结构域激活环中的酪氨酸残基自动磷酸化。配体介导的rtk低聚导致两步激活，催化活性增加以及下游信号传导蛋白停靠位点的创建。[0778]通常，rtk均二聚化以进行信号传导。[0779]rtk自动磷酸化可能发生在顺式或反式中。磷酸化的酪氨酸残基构成许多含sh2信号传导分子的停靠位点。一般来说，所有的rtk都通过共同的下游信号蛋白，例如pi3激酶、ras‑raf‑mapk、jnk和plcγ，进行信号传导。信号传导由jak‑stat通路介导。[0780]活性调节剂可以是受体酪氨酸激酶(rtk)，其能够在不存在同源配体的情况下进行信号传导。此类rtk描述于英国专利申请案第1803079.1号中。[0781]rtk可以过表达和/或包含突变，使得其能够在不存在同源配体的情况下进行信号传导。[0782]rtk可以是嵌合rtk。嵌合rtk可以包含介导嵌合rtk二聚化或低聚化的胞外域或胞内域。[0783]介导嵌合rtk的二聚化或低聚化的结构域可以包含二硫键，例如其可以是铰链结构域或包括铰链结构域。[0784]或者，介导嵌合rtk的二聚化或低聚化的结构域可以包括可化学操作的二聚化或低聚化结构域。嵌合rtk的二聚化或低聚化可以通过试剂诱导。[0785]表4中示出了人rtk亚家族和rtk的汇总。[0786]表4[0787][0788][0789]表5中提供了表2中所示的人rtk的示意性的uniprot登录号和相关氨基酸序列。[0790]表5[0791][0792][0793][0794]调节靶细胞活性[0795]活性调节剂可以调节靶细胞(例如肿瘤细胞)的活性。[0796]例如，试剂可以是毒素，例如对肿瘤细胞有毒的毒素。例如，试剂可以是白喉毒素、假单胞菌毒素或志贺氏菌毒素。[0797]或者，活性调节剂可以是前体药物或前体药物激活化合物。活性调节剂可以是前药激活酶。[0798]前药广泛用于将细胞毒化合物靶向递送到癌细胞。前药是药物分子的无活性或活性较低的衍生物，它们经过酶或化学转变以再生成活性形式。[0799]在靶向癌症疗法中，缺乏内在靶标特异性的常规化学治疗剂经合理地修饰以将其细胞毒性集中并重新定向于肿瘤细胞。许多常规的非特异性化学治疗剂(例如阿霉素、紫杉醇、喜树碱、顺铂及其衍生物)的有用性已通过修饰成前药(尤其是怀有细胞靶向部分的前药)而得到了显著延伸。[0800]活性调节剂可以是酶，其激活单独施用于细胞毒性产物的特异性失活底物(前药)。活性调节剂可以是或包含胞嘧啶脱氨酶(cd)，其将前药5‑氟胞嘧啶(5‑fc)转化为5‑氟尿嘧啶(5‑fu)，其下游抗代谢物导致所谓的“胸腺嘧啶缺陷致死”。或者，活性调节剂可以是或包含胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合体(cd/uprt；由fcy::fur基因编码)，其也已用于产生基于5‑fu的抗代谢物。其它抗代谢物前药包括核苷类似物，例如阿昔洛韦和更昔洛韦，其使用重组胸苷酸激酶被激活为其活化型三磷酸酯，以及6‑甲基‑2’‑脱氧核苷和2‑氟‑2’‑脱氧腺苷，后两者分别通过嘌呤核苷磷酸化酶转化为6’‑甲基嘌呤和2‑氟腺嘌呤。人脱氧胞苷激酶(dck)和胸苷酸激酶(tmpk)能够单磷酸化一系列(非生理性)前药，例如吉西他滨(dfdc)，溴乙烯基脱氧尿苷(bvdu)，阿糖胞苷(arac)和3’‑叠氮‑3’‑脱氧胸苷(azt)单磷酸酯。还开发了dck与尿苷单磷酸激酶(dck::umk)的嵌合融合体，从而在胰腺癌中将吉西他滨直接激活为细胞毒性二磷酸代谢物(dfdcdp)。还有一些“设计性”前药，其中化疗剂衍生为特定活化酶的底物。实例包括：通过青霉素‑v酰胺酶水解的阿霉素和美法仑的苯氧乙酰胺缀合物，通过重组羧酸酯酶水解的依托泊苷(vp‑16)的二哌啶基缀合物，以及经设计用于通过β‑内酰胺酶水解的5‑fu的头孢菌素缀合物。[0801]活性调节剂可以是能够切割前药缀合物(例如，包含毒素的前药缀合物)的酶。与前药缀合物一样，许多靶向的毒素由靶向部分(例如，在免疫毒素的情况下，为抗体)、可裂解的接头和药物(细胞毒性酶)组成。moxetumomab pasudotox由来自绿脓杆菌的截短的外毒素a组成；其中天然受体结合结构域(位于n端250残基中)已被靶向细胞表面cd22抗原的单链可变片段取代。细胞毒性活性完全由c端片段(405至613的残基，称为pe3)提供。实际上，该缀合物是无活性的毒素：细胞毒性激活需要在残基279和280之间的内吞过程中通过弗林蛋白酶蛋白酶进行蛋白酶切割。因此，moxetumomab pasudotox在功能上是靶向前药缀合物，其中来自外毒素a(结构域ii)的251至364位残基充当接头，它的裂解造成细胞毒性pe3的释放。[0802]1.生物合成的car t细胞[0803]活性调节剂可以是酶，其当在细胞中表达或组合表达时能够合成小分子。[0804]国际专利申请案pct/gb2018/053262描述了编码转基因合成生物学途径的工程化细胞，所述途径使工程化细胞能够产生小分子，特别是治疗性小分子。所述工程化细胞可包含：(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)编码一种或多种酶的一种或多种工程化多核苷酸，所述酶在细胞中组合表达时能够合成治疗性小分子。[0805]例如，可以有一种、两种、三种、四种或五种酶。所述一种或多种酶可以在一个或多个开放读码框中编码。所述一种或多种酶可以在单个开放读码框中编码。适当地，每种酶可以通过切割位点分离。所述切割位点可以是自切割位点，例如编码fmd‑2a样肽的序列。[0806]所述治疗小分子可以是例如细胞毒性分子；细胞抑制分子；能够诱导肿瘤分化的试剂；或促炎分子。特别地，小分子可以是紫色杆菌素或其衍生物，或香叶醇。[0807]靶细胞微环境调节剂[0808]活性调节剂可以是调节靶细胞(例如，肿瘤细胞)的环境的试剂。[0809]例如，试剂可以是如上所述的细胞因子(例如，il‑7或il‑12)或趋化因子(例如，ccl19)。或者，如上所述，试剂可影响细胞因子或趋化因子的表达或活性。[0810]1.分泌酶的car‑t细胞[0811]免疫微环境含有小分子代谢物和营养物，其可以改变肿瘤存活和/或进程与免疫应答之间的平衡。微环境的调节可以改变有利于免疫应答的平衡和/或可以改善适应性免疫疗法的活性或功效，例如表达car或转基因tcr的工程化细胞的功效。[0812]与本发明有关的活性调节可以调节肿瘤微环境中一种或多种代谢物或营养物质的水平，使平衡偏向有利于免疫细胞，例如参与免疫应答的t细胞，和/或远离肿瘤细胞。[0813]例如，活性调节剂是一种或多种酶，当在细胞表面分泌或表达时，其导致工程化细胞胞外分子的耗竭，所述分子：[0814](i)是肿瘤细胞生存、增殖、转移或化学抗性所需的，和/或[0815](ii)对工程化细胞的存活、增殖或活性有害。[0816]英国申请案第1820443.8号描述了在细胞表面分泌或表达此类酶的工程化细胞。[0817]酶可以导致氨基酸或氨基酸代谢物、核碱基(如核苷或核苷酸)或脂质的耗竭。[0818]在活性调节剂导致肿瘤细胞生长或存活所需的营养物或代谢物的耗竭的情况下，免疫细胞(例如，car‑t细胞)可以进行工程化，从而可以在细胞外环境中在不存在所述分子的情况下存活。例如，细胞可以进行工程化以在细胞内合成分子或其前体。[0819]细胞组合物[0820]本发明还提供了通过本发明的方法制备的细胞组合物。[0821]本发明提供了通过用多种病毒载体转导细胞而制得的细胞组合物，使得所述组合物包含未转导细胞、单转导细胞和组合转导细胞的混合物。[0822]在本发明的方法中使用的病毒载体的混合物中的至少一种载体包含编码car的核酸序列。因此，所述细胞组合物可以包含单一转导和组合转导的car表达细胞的混合物。[0823]“组合转导”是指用至少两种病毒载体转导细胞。举例而言，如果用两种载体转导细胞，其中一种包含转基因a，另一种包含转基因b，则转导的细胞将为下列细胞的混合物：表达单独的a的细胞；表达单独的b的细胞；和表达a和b两者的细胞。在这种情况下，表达a和b的细胞被组合转导。[0824]对于用三种载体转导的细胞，其中每种载体包含一种转基因，得到的转导细胞将是下列细胞的混合物：表达单独的a的细胞；表达单独的b的细胞；表达单独的c的细胞；表达a和b的细胞；表达a和c的细胞；表达b和c的细胞；以及表达a、b和c的细胞。在该情况下，表达a和b；a和c；b和c的三个亚群以及表达a、b和c的细胞被组合转导。[0825]细胞组合物包含多个亚群，所述亚群通过用所述病毒载体的混合物中的不同载体组合转导衍生。[0826]细胞组合物可以包含溶细胞免疫细胞，例如t细胞和/或nk细胞。[0827]t细胞或t淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的淋巴细胞类型。由于细胞表面存在t细胞受体(tcr)，可以将它们与其它淋巴细胞(例如，b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞))区分开来。如下文所概述，存在各种类型的t细胞。[0828]辅助型t辅助细胞(th细胞)协助免疫过程中的其它白血细胞，包括使b细胞熟化为浆细胞和记忆b细胞，以及细胞毒t细胞和巨噬细胞的激活。th细胞在其表面表达cd4。当通过抗原提呈细胞(apc)表面上的mhc ii类分子提呈肽抗原给th细胞时，所述th细胞会被激活。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括th1、th2、th3、th17、th9或tfh，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。[0829]溶细胞性t细胞(tc细胞或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，也涉及移植排斥。ctl在其表面表达cd8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞表面的mhc i类相关的抗原结合来识别其靶标。通过il‑10、腺苷和调节性t细胞分泌的其它分子，可以使cd8+细胞失活至无能状态，从而预防自身免疫性疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎。[0830]记忆t细胞是抗原特异性t细胞的子集，其在感染解决后长期存活。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩展为大量效应t细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆t细胞包括三种亚型：中央记忆t细胞(tcm细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4+或cd8+。记忆t细胞通常表达细胞表面蛋白cd45ro。[0831]调节性t细胞(treg细胞)，以前称为抑制性t细胞，对于维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是在免疫反应即将结束时关闭t细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性t细胞。[0832]已经描述了两大类cd4+treg细胞‑天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。[0833]天然存在的treg细胞(也称为cd4+cd25+foxp3+treg细胞)产生于胸腺中，并与发育中的t细胞与已被tslp激活的髓样(cd11c+)和浆细胞样(cd123+)树突状细胞之间的相互作用有关联。由于称为foxp3的细胞内分子的存在，可以将天然存在的treg细胞与其它t细胞区分开。foxp3基因的突变可以阻止调节性t细胞的发育，从而引起致命的自身免疫性疾病ipex。[0834]适应性treg细胞(也称为tr1细胞或th3细胞)可能起源于正常的免疫应答期间。[0835]自然杀伤细胞(或nk细胞)构成先天免疫系统的一部分。nk细胞以独立于mhc的方式对来自病毒性感染细胞的先天信号提供快速响应。[0836]nk细胞(属于先天淋巴样细胞)被定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)，并构成由产生b和t淋巴细胞的普通淋巴祖细胞分化而来的第三种细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟，然后进入循环。[0837]本发明的细胞可以是上述细胞类型中任何一种。[0838]用本发明的方法转导的细胞可以来源于血液样品，例如来源于白细胞采集物(leukapheresate)。所述细胞可以是或包括外周血单个核细胞(pbmc)。[0839]细胞可以从以下三方离体产生：患者自己的外周血(第1方)，或来自供体外周血的造血干细胞移植的环境中(第2方)，或来自未连接的供体的外周血(第3方)。[0840]或者，细胞可以来源于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如t细胞或nk细胞。或者，可以使用永生化t细胞系，细胞系保留其裂解功能并可以用作治疗剂。[0841]在用编码提供根据本发明第一方面的嵌合多肽的分子的核酸转导之前，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理，可以激活和/或扩增细胞。[0842]在转导后，然后可以纯化细胞，例如基于car的表达来选择细胞。当存在转导后的细胞亚群(其在car不存在的情况下表达活性调节剂)时，希望基于car表达选择细胞。在病毒载体混合物中的每一个载体包含编码car的核酸序列的情况下，可能不需要基于car表达纯化或分选细胞，因为在不存在car的情况下，任何细胞都不可能表达活性调节剂。[0843]药物组合物[0844]本发明的细胞组合物，包含单独转导和组合转导的car表达细胞的混合物，其可以作为药物组合物给患者施用。[0845]药物组合物可以另外包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。所述药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以例如为适合静脉内输注的形式。[0846]治疗方法[0847]本发明提供了用于治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的细胞组合物(例如，如上所述的药物组合物中的细胞组合物)的步骤。[0848]治疗疾病的方法涉及本发明的细胞组合物的治疗性使用。可以将所述细胞组合物施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减少、减轻或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减轻或阻断疾病的进展。[0849]预防疾病的方法涉及本发明的细胞组合物的预防性使用。可将所述细胞组合物施用于尚未染上所述疾病和/或未表现出所述疾病的任何症状的受试者，以预防或减少发病，或减轻或预防与所述疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能对所述疾病有易感性，或认为有发展成所述疾病的风险。[0850]方法可以涉及以下步骤：[0851](i)分离含有细胞的样品；[0852](ii)用至少两种病毒载体的混合物转导此类细胞；[0853](iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。[0854]本发明还提供了一种用于治疗和/或预防疾病的本发明的细胞组合物。[0855]本发明还涉及本发明的细胞组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。[0856]通过本发明的方法治疗的疾病可以是癌性疾病，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。[0857]疾病可以是多发性骨髓瘤(mm)、b细胞急性淋巴母细胞性白血病(b‑all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、神经母细胞瘤、t细胞急性淋巴母细胞性白血病(t‑all)或弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。[0858]疾病可以是浆细胞疾病，例如浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变性、waldenstrom巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明单克隆抗体病或郁积型多发性骨髓瘤。[0859]本发明的组合物的细胞能够杀伤靶细胞，例如癌细胞。靶细胞的特征可以是在靶细胞附近存在肿瘤分泌的配体或趋化因子配体。靶细胞的特征可以是在靶细胞表面存在可溶性配体以及肿瘤相关抗原(taa)的表达。[0860]在具有相同疾病的不同患者之间以及在同一患者内的不同疾病部位(例如肿瘤部位)之间，本发明的组合物内的细胞的不同亚群可具有不同水平的杀伤靶细胞的能力。[0861]基于结果工程化改造表达car的细胞[0862]本发明还提供了用于确定car表达细胞的组分的最佳组合以治疗疾病的方法。[0863]如上所述，本发明的细胞组合物包含car表达细胞的混合物，其中一些是单一转导的，而另一些是组合转导的。不同亚群的数量将取决于用于转导的混合物中病毒载体的数量。对于三种载体a、b和c，应当存在如下转导获得的七个转导细胞群：a单独转导；b单独转导；c单独转导；a和b转导；a和c转导；b和c转导；以及a、b和c转导。对于四种载体a、b、c和d，应当存在如下转导获得的15个不同的亚群：a单独转导；b单独转导；c单独转导；d单独转导；a和b转导；a和c转导；a和d转导；b和c转导；b和d转导；a、b和c转导；a、b和d转导；a、c和d转导；b，c和d转导；以及a、b、c和d转导。[0864]如果组合物中的每个载体包含编码car的核酸和/或编码活性调节剂的核酸，则所述细胞组合物将是转导细胞的混合物亚群，其中每一个表达car和活性调节剂的不同组合。[0865]例如，病毒载体的混合物可以表达一种或多种car和多种不同的活性调节剂。通过用载体混合物转导细胞而制备的car表达细胞将表达活性调节剂的多种不同组合，这可以赋予car表达细胞在靶细胞杀伤、存活、植入、检查点抑制耐受和/或不利肿瘤微环境耐受方面不同的性质。在体内，表达car和活性调节剂的特定组合的一个细胞亚群将最适合患者体内或患者体内特定部位的特定病症。所述亚群将获得最有效的激活、存活和/或增殖信号，并将从细胞组合物中的其它亚群中“胜出”。[0866]通过在施用后分析患者体内的car表达细胞，可以确定哪种亚群最适合存活、移植和杀伤靶细胞。通过分析该亚群的表型或基因型，可以推算出在细胞组合物的制备过程中哪种载体组合成功转导了亚群。[0867]该信息可用于设计同质的表达car的细胞组合物，其中每个转导的细胞表达car和活性调节剂的最成功的组合。[0868]方法可以包括以下步骤：[0869](i)向患有该疾病的受试者施用细胞组合物；[0870](ii)监测患者或来自患者的样品，以确定所述细胞组合物中哪种细胞亚群显示出最大水平的存活、植入、增殖活化和/或靶细胞杀伤；和[0871](iii)分析所述亚群中细胞的表型/基因型，以确定这些细胞表达的car和/或活性调节剂。[0872]还提供了产生用于治疗疾病的表达car的细胞组合物的方法，其包括以下步骤：为了用上述方法治疗疾病，确定car表达细胞的组分的最佳组合，然后用表达鉴定出的组分的组合的单一载体转导细胞。在所有car表达细胞将表达相同的组分的组合的意义上，所得的细胞组合物将是同质的。[0873]还可以用表达鉴定出的组分的组合的两种或更多种载体转导细胞，然后对表达所有鉴定出的组分的细胞进行分选，以获得同质的表达car的细胞组合物。[0874]本发明还提供了通过这种方法制备的细胞组合物。[0875]现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围。实施例[0876]实施例1‑用多种载体转导的car‑t细胞组合物的产生[0877]产生慢病毒载体，所述慢病毒载体表达：a)wo2016/139487中描述的第二代抗cd19 car，其包含抗cd19抗原结合结构域，cd8茎间隔区和跨膜结构域，以及复合4‑1bb‑cd3ζ胞内域，处于pgk启动子的控制下(pccl.pgk.acd19cat‑cd8stk‑41bbz)；或b)抗cd22 car，其具有上述seq id no.10‑15所示的cdr，cd8茎间隔区，和包含cd3ζ和4‑1bb共刺激结构域的第二代胞内域，处于ef1α启动子的控制下(pccl.ef1a.acd22_9a8‑1‑64_lh_scfv‑cd8stk‑41bbz)。[0878]产生两种单独的慢病毒上清液，并在2.5+2.5的moi下1:1混合。通过流式细胞术研究了两种car的表达模式：使用抗独特型抗体染色以表达抗cd19 car，使用可溶性cd22染色以表达cd22 car。结果显示在图6中。用慢病毒组合物转导后，细胞是下列各项的混合物：未转导的细胞(46.5％)；表达单独的抗cd19 car的细胞(23.1％)；表达单独的抗cd22 car的细胞(11.1％)和表达cd19和cd22 car两者的细胞(19.3％)。[0879]实施例2‑通过用多种载体转导以组合方式表达car与增强模块的组合[0880]构建载体，其包含第二代抗cd19 car(fmc63‑41bbz)与标志物基因以及以下增强模块之一的组合，所述增强模块预测在特定条件下展现活性：[0881]dnshp2‑shp2的截短形式，其具有sh2结构域，但缺乏磷酸酶结构域。序列如上述seq id no.29所示。截短蛋白充当显性负性，并与野生型蛋白竞争与抑制性免疫受体(如pd1)上的磷酸化itim的结合。[0882]dntgfbrii‑显性负性tgfβ受体，其缺少激酶结构域。序列如上述seq id no.46所示。dntgfbrii与野生型tgf‑β受体竞争与tgf‑β的结合，从而下调tgf‑β介导的信号传导。[0883]ccr‑组成型活性嵌合细胞因子受体，具有il‑2、il‑7或gm‑csf受体胞内域，如上所述。此类组成型活性ccr的组分的序列如上述seq id no.30‑43给出。此类受体的存在引起组成型细胞因子信号传导(即，在不存在相关细胞因子的情况下)。[0884]构建了包含以下盒的逆转录病毒载体，其中gfp、mkate和rqr8是标志物基因：[0885]载体a‑car+dnshp+gfp[0886]载体b‑car+dntbrii+mkate[0887]载体c‑car+ccr+rqr8[0888]以2.5:2.5的moi用1:1混合物中编码上述载体中的两种的两种逆转录病毒的混合物转导t细胞。所得的混合群包含：表达第一载体，或第二载体，或两种载体一起的t细胞。通过流式细胞术测量标志物基因的表达来检测和测量转导。例如，对于用载体a和b的混合物转导的细胞，使用标志物基因gfp和mkate检测和测量转导。[0889]转导的t细胞群用染料细胞痕量紫(cell trace violet，ctv)标记，这是一种荧光染料，其水解并保留在细胞内。其通过405nm(紫色)激光激发，并且可以在太平洋蓝(pacific blue)通道中检测荧光。在pbs中以2×106个细胞/ml重悬t细胞，并添加1ul/ml的5mm ctv。将t细胞与ctv在37℃下温育20分钟。随后，添加5v的完整培养基淬灭细胞。5分钟温育后，洗涤t细胞并将其在2ml完全培养基中重悬。在室温下再温育10分钟，使其发生乙酸盐水解并保留染料。[0890]标记的t细胞与表达cd‑19的靶细胞共培养四或七天。为了研究在包含载体a的载体混合物中dnshp2增强模块的功能，使用共表达靶抗原与pdl1的靶细胞。为了研究在包含载体b的载体混合物中dntbrii增强模块的功能，在可溶性tgf‑β存在下将t细胞与靶细胞共培养。[0891]测定在0.2ml总体积的96孔板中进行，使用每孔5×104个转导的t细胞和相等数量的靶细胞(比率1:1)。在第4天或第7天的时间点，通过流式细胞术分析t细胞，以测量随着t细胞分裂而发生的ctv的稀释。计算共培养结束时存在的t细胞数量，并表示为与t细胞的输入数量相比增殖的倍数。[0892]模块中对应于靶细胞施加的免疫抑制的优先扩增通过该群体中细胞痕量紫染料的减少和通过对应于该群体的标志物的增加来评估。[0893]实施例3‑通过用两个独立的逆转录病毒载体双重转导产生具有增强模块的抗gd2‑car‑t细胞产品[0894]背景：神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外实体癌，在高危疾病患者中长期生存较差。[0895]目前正在进行的用于难治性/复发性神经母细胞瘤的靶向gd2的cart的i期临床研究(nct02761915)显示出针对弥散性疾病的活性，而未诱导在靶点非肿瘤(on target/off tumor)毒性。然而，cart持久性有限，临床活性短暂且不完全。[0896]在本研究中使用的gd2 car的基础上，我们已开发了下一代t细胞产品候选，称为auto6ng。auto6ng产品由通过用两种单独的逆转录病毒载体双重转导t细胞产生的靶向gd2的car t细胞的3个不同群体组成。第一载体导向靶向gd2的car的表达，所述car与组成型信号传导il7细胞因子受体(il7r_ccr)或组成型信号传导il2细胞因子受体(il2r_ccr)共表达(产物a)，而第二载体是编码相同gd2 car的三顺反子逆转录病毒载体，所述car与显性负性tgfbrii(dntgfbrii)和截短的shp2(dshp2)共表达(产物b)。dshp2赋予对诸如来自pd1的抑制性信号的抗性。[0897]载体设计在图7中示意性地示出。[0898]gd2 car如wo2015/132604中所述，其具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：具有如seq id no.77所示序列的vh结构域和具有如seq id no.78所示序列的vl结构域。[0899]组成型信号传导il2和il7细胞因子受体如wo2017/029512中所述，il2ccr包含具有il‑2受体β链胞内域(seq id no.40)的第一多肽和包含共同γ链受体胞内域(seq id no.39)的第二多肽；而il7 ccr包含具有il‑7受体α链胞内域(seq id no.41)的第一多肽和包含共同γ链受体胞内域(seq id no.39)的第二多肽。[0900]分选/自杀基因rqr8如wo2013/153391中所述，且具有如seq id no.79所示的序列。[0901]显性负性tgfbrii(dntgfbrii)具有如上seq id no.46所示的序列。[0902]截短的shp2(dshp2)具有如上seq id no.29所示的序列。[0903]实施例4‑研究体外单一和双重转导细胞的细胞毒性能力以及各种载体表达件的功能[0904]人t细胞用两种载体双重转导，从而得到a/b/a+b产物的混合物(auto6ng)，或者用每种载体单独单一转导，从而得到产物a或b。对照包括非转导细胞(nt)和表达单独的gd2 car的细胞。[0905]i)细胞毒性测定[0906]将各种效应细胞类型与表达gd2的supt1靶细胞(supt1 gd2)或对照非转导靶细胞(supt1 nt)共培养72小时，并通过流式细胞术分析靶细胞裂解的百分比。结果显示在图8中。所有表达car的效应细胞都能够杀伤表达gd2的靶细胞。用双重载体组合物转导的t细胞(产物a/b/a b)在针对gd2阳性肿瘤细胞系的细胞毒性测定中具有高度效力，与单一转导的car t细胞(产物a或b)相比，没有观察到差异。[0907]ii)ccr的验证[0908]用细胞痕量紫(ctv)标记上述各种转导的car t细胞和对照nt t细胞，并在没有进一步抗原刺激的情况下在无细胞因子的完整细胞培养基中培养7天。将体外持久性定量为已稀释ctv染料的增殖细胞的百分比，和7天后的绝对car t细胞计数。结果显示在图9中。与未转导的细胞(nt)、用表达单独的gd2 car的载体转导的细胞或用表达单独的产物b的载体转导的细胞(gd2 car+dshp2+dtgfbrii)相比，用表达组成型信号传导il7细胞因子受体(il7r_ccr)或组成型信号传导il2细胞因子受体(il2r_ccr)的产物a转导；或用产物a+b转导的t细胞显示增殖增加。il2或il7r_ccr的表达赋予了修饰的t细胞独立于外源性细胞因子的存活力和自稳增殖，而不引起自发的t细胞生长。[0909]iii)dtgfbrii的验证[0910]将上述各种转导的car t细胞和对照nt t细胞与表达gd2的supt1靶细胞(supt1 gd2)或对照非转导靶细胞(supt1 nt)以1:2或1:8e:t比率，在存在或不存在10ng/ml tgfβ的情况下共培养7天。通过流式细胞术分析靶细胞的杀伤，并通过elisa分析ifnγ的分泌。结果分别如图10和11中所示。与表达单独的gd2 car的car‑t细胞，或用表达单独的产物a(gd2 car+il2 ccr或gd2 car+il7 ccr)的载体转导的细胞相比，用表达dntgfbrii的产物b转导；或用产物a+b转导的car t细胞显示对tgfβ介导的抑制靶细胞杀伤的抗性。用产物b或产物a+b转导的car t细胞显示，在存在tgfβ的情况下，ifnγ的分泌恢复到与不存在tgfβ的情况下所观察到的相当的水平。相比之下，tgfβ的存在显著抑制表达单独的gd2 car的car‑t细胞或用表达单独的产物a的载体转导的细胞的ifnγ分泌。因此，表达dntgfbrii的t细胞证明对tgfβ介导的体外免疫抑制具有抗性。[0911]实施例5‑研究在神经母细胞瘤异种移植模型中双重转导的car‑t细胞产品的体内抗肿瘤活性。[0912]采用体内测定研究在nsg小鼠中建立的神经母细胞瘤异种移植模型中通过静脉内施用，用双重载体组合物转导的t细胞的抗肿瘤活性。给10至14周龄的雌性nsg小鼠静脉内注射100万个表达萤火虫萤光素酶的chla‑255细胞(chla‑255ffluc)。让异种移植物建立15天，直到通过bli可检测到稳定的植入。通过用表达gd2 car的单一载体(gd2 car)转导细胞或通过用实施例3中描述并在图7中示出的双重载体组合物(gd2 car+il7 ccr/gd2 car+dshp2+dtgfbrii)转导细胞来制备car‑t细胞。给小鼠静脉内注射10×106个car‑t细胞(50％转导效率)，3×106个car‑t细胞(50％转导效率)，20×106个nt t细胞(t细胞总量相当于10×106个car t细胞剂量)或pbs。14天后，通过每两周一次的生物发光成像评估肿瘤生长。[0913]结果显示在图12中。静脉内递送表达单独的简单gd2 car的car t细胞对肿瘤生长没有显著影响(图12a和b)。相比之下，以3×106和10×106两个剂量静脉内递送用双重载体组合物转导的car t细胞在具有建立的肿瘤负荷的nsg小鼠中表现出有效力的抗肿瘤活性和延长的生存(图12c和d)。[0914]实施例6‑通过用三种独立的逆转录病毒载体三重转导产生具有增强模块的抗psma car t细胞产品[0915]本发明人开发了一种用于治疗前列腺癌的组合型/多模块car t治疗剂(“auto7”)，其由以下几个功能模块组成：1)具有第二代cd28‑cd3z复合胞内域(7a12‑28z)的抗psma car；2)安全开关rapacasp9，其描述于wo2016/135470中并且具有如上述seq id no.80所示的序列；3)诱导tgfβ1抗性的显性负性tgfβrii(dntbrii)，其具有如上述seq id no.46所示的序列；4)用于pd1/pd‑l1通路抑制的截短的shp2(dnshp2)，其具有如上述seq id no.29所示的序列；5)如上所述用于诱导增殖的组成型活性il7受体(ccr_il7)；6)分选‑自杀基因rqr8，其具有如seq id no.79所示的序列；和7)用于淋巴细胞招募/活化的超低分泌il‑12(flexiil‑12)，其位于具有如seq id no.81所示序列的停止‑跳跃序列(stop‑skip sequence，ss)的下游。载体设计如图13a中所示。[0916]第一载体(a)编码dnshp2、自杀基因rqr8，car和dntbrii；第二载体(b)编码组成型活性il7受体；第三载体(c)编码第二自杀基因：rapcasp9；和flexi‑il12。[0917]在载体a和载体c上具有不同的自杀基因提供了灵活性。如果在患者中观察到与car相关的毒性，则有可能以通常的方式用利妥昔单抗治疗患者来选择性地去除表达car的细胞，从而经由rqr8分选/自杀基因触发这些细胞凋亡。然而，如果观察到认为与il‑12分泌有关的毒性，则可以通过添加雷帕霉素或雷帕霉素类似物触发经由rapacasp9自杀基因的凋亡来选择性地破坏用载体c转导的细胞。由于治疗性产物包含用三种载体的混合物转导的细胞，因此它将是组合产物，具有用一种、两种或全部三种载体的所有各种组合转导的不同的细胞亚群。这意味着一些表达car的细胞应当从rapacasp9自杀基因的触发存活下来。例如，用单独的载体a转导的细胞或用载体a和b的组合转导的细胞将不表达rapacasp9，并且应当不受雷帕霉素治疗的影响。这意味着可以在体内“修饰”治疗产物并选择性地删除表达il‑12的细胞，同时留下一定比例的表达car的细胞以维持car介导的抗肿瘤作用。[0918]据研究，auto7为：使用载体a的单一转导的产物(“auto7/a”)，或使用载体a和b的双重转导的产物(“auto7/ab”)，或使用载体a、b和c的三重转导的产物(“auto7/abc”)。针对使用相同的抗psma结合物7a12(“亲代”)开发的第二代car测试auto7。[0919]实施例7‑研究体外单一、双重和三重转导细胞的细胞毒性能力以及各种载体表达件的功能[0920]采用基于facs的杀伤测定研究了上述用单一、双重和三重载体组合转导的t细胞杀伤靶细胞的能力。将经工程化以表达不同水平的人psma抗原的supt1靶细胞(supt1‑psma高,supt1‑psma低)用作靶细胞。将非工程化的supt1细胞(supt1‑nt)用作阴性对照。将car t细胞与靶细胞以1:2效应与靶标比率共培养。在温育24小时后通过细胞荧光分析法分析测定fbk，且结果显示在图14a中。通过在24小时从所述的共培养物中收集上清液并通过elisa检测来测量car t细胞分泌il‑2和ifnγ，且结果分别显示在图14b和c中。[0921]据发现，使用载体a单一转导所产生的细胞组合物(“auto7/a”)，使用载体a和b的双重转导所产生的细胞组合物(“auto7/ab”)或使用载体a，b和c的三重转导所产生的细胞组合物(“auto7/abc”)在针对psma阳性肿瘤细胞系的细胞毒性测定中具有高度效力。细胞毒性和细胞因子释放与使用相同的抗psma结合物7a12(“亲代”)(其用作单独car的对照)开发的第二代car所观察到的相当。[0922]为了研究在不存在il‑2的情况下培养后单一、双重和三重转导的auto7 t细胞杀伤靶细胞的能力，将转导的t细胞在饥饿条件下用未补充il2的培养基培养7天。7天后，对car t细胞进行计数，并将其与supt1‑psma高和supt1‑psma低靶细胞(或supt1‑nt细胞作为阴性对照)一起铺板。将car t细胞与靶细胞以1:2和1:8效应与靶标比率共培养。在温育24小时后通过细胞荧光分析法分析测定fbk(图15a)。通过在24小时从所述的共培养物中收集上清液，并通过elisa检测来测量car‑t细胞分泌il‑2和ifnγ(图15b)。[0923]已发现，尽管表达对照car的细胞和用单独的载体a转导的细胞在饥饿条件下培养后表现出对细胞毒性和细胞因子释放的抑制，但对于用双重或三重载体组合(载体a+b或a、b+c)转导的细胞，这种作用不太明显。载体b包含表达组成型活性细胞因子受体il7r_ccr模块的基因。该模块的表达赋予细胞因子独立的存活力和增殖，而不干扰细胞毒性；因为饥饿后，用auto7/ab或auto7/abc转导的细胞显示出仍可有效杀伤表达psma的靶细胞。[0924]为了研究在tgfβ存在下，单一、双重和三重转导的auto7 t细胞杀伤靶细胞的能力，在存在或不存在10ng/ml tgfβ1的情况下，将转导的t细胞与supt1‑psma高和supt1‑psma低靶标以比率1:2和1:8(e:t)共培养7天(supt1‑nt用作对照)。靶细胞杀伤通过facs定量，并对单独的靶标进行标准化。结果显示在图16中。[0925]在1:8的e:t比率下，通过向培养基中添加tgfβ1来抑制表达单独的car的对照t细胞对靶细胞的杀伤。对于用载体组合a；a+b；或a,b+c的任何一个转导的细胞，这种抑制作用都降低。载体a编码dntgfβri件，该件先前已显示阻断tgfβ介导的对t细胞信号传导的抑制。[0926]为了研究重复暴露于靶抗原后单一、双重和三重转导的auto7 t细胞杀伤靶细胞的能力，将转导的细胞与supt1‑psma高或supt1‑psma低靶细胞以1:1比率(e:t)共培养，且每7天用5×104个supt1细胞重新刺激car‑t细胞。在每次新的重新刺激之前，通过facs定量靶细胞杀伤。结果显示在图17中。[0927]经过两次重新刺激事件(第2周)后，用载体组合a+b或a+b+c转导的细胞显示比单独的car或载体a转导的细胞更好地杀伤靶细胞。经过三次重新刺激事件(第3周)后，用载体组合a+b+c转导的细胞显示出对靶细胞的最佳杀伤。[0928]实施例8‑研究体内单一、双重和三重转导的细胞的细胞毒性能力以及各种载体表达件的功能[0929]采用体内测定研究在nsg小鼠中建立的神经母细胞瘤异种移植模型中通过静脉内施用，用单一、双重和三重载体组合物转导的t细胞的抗肿瘤活性。[0930]给雌性nsg小鼠侧腹注射5×106个psma阳性pc3人细胞系。让异种移植物建立3周，直至通过触诊和卡尺测量可检测到稳定的植入。以1×106个car‑t细胞/小鼠的剂量i.v.施用car‑t细胞。卡尺测量每周进行2/3次。结果显示在图18中。[0931]用表达单独的car的t细胞治疗(肠胃外)的小鼠相比接受非转导细胞的小鼠显示出缓慢的肿瘤生长，但肿瘤生长不受控制。接受编码car、dnshp2和dntgfβrii的载体a转导的t细胞的小鼠显示肿瘤中的初始生长(9月9日)，随后肿瘤尺寸减小(9月23日)。在研究结束时，观察到肿瘤生长的恢复(10月7日)。[0932]接受用载体a+b转导的t细胞的小鼠显示出肿瘤中的初始生长(9月9日至16日)，但随后肿瘤尺寸减小，并且在研究期间这一作用一直持续。三重转导的auto7 car t细胞完全根除肿瘤，没有中毒的迹象。载体组合，尤其是a+b和a+b+c在减少异种移植模型中小鼠的肿瘤生长和促进小鼠生存方面显示出比单独的car有显著的改善。[0933]结果证明多模块auto7产品的可行性和功效。向抗psma car产品中添加il7r_ccr、ss_fil12、dntgfβrii和dshp2模块通过扩展持久性、增殖、激活和对tgfβ1和pd1/pdl1驱动的免疫抑制的抗性增强了t细胞功能。[0934]方法论[0935]结合物产生[0936]通过cdr移植源自基因接种的大鼠的抗psma抗体而产生psma‑结合物。[0937]细胞系[0938]在补充有10％胎牛血清(fbs)和1％glutamax的rpmi‑1640培养基中培养pc3细胞、supt1细胞系(nt和psma+)。从外周血单个核细胞(pbmc)中分离出t细胞，并将其保持在补充有10％fbs、1％glutamax和100u/ml il‑2的rpmi‑1640培养基中。[0939]转导[0940]通过采用rdf质粒(rd114包膜)、gag/pol质粒和car质粒使用genejuice瞬时转染hek293t细胞而产生逆转录病毒。在48小时和72小时收获逆转录病毒上清液。在t175 tc处理的烧瓶中使用0.5μg/ml的抗cd3和抗cd28抗体刺激t细胞，并保持在100u/ml il‑2中。在t细胞转导之前，将非tc处理的六孔板用retronectin包被，并在4℃下温育24小时。在添加1ml浓度为1×106个细胞/ml的活化t细胞之前，将总共3ml的病毒上清液铺板，然后添加100u/ml的il‑2，并于室温下以1000xg离心40分钟，并在37℃，5％co2下温育2‑3天。[0941]将人t细胞：[0942]用载体a、b和c载体三重转导，从而产生混合产物(auto7/abc)[0943]用载体a和b双重转导，从而产生混合产物(auto7/ab)[0944]用载体a单一转导，从而产生单一产物(auto7/a)[0945]细胞毒性测定[0946]将car‑t细胞与supt1‑nt和supt1‑psma以1:2或1:8效应与靶标比率(e:t比率)在tc处理的96孔板上共培养。共培养后24小时取读出(readout)，通过用抗cd3‑pecy7和qben10‑apc染色以区分效应t细胞和靶细胞，并使用sytox blue7‑aad死细胞染色以排除死细胞。通过流式细胞术细胞毒性读出。[0947]tgf存在下的细胞毒性测定[0948]将car t细胞与supt1‑nt和supt1‑psma高和supt1‑psma低以1:2或1:8效应与靶标比率(e:t比率)在tc处理的96孔板上共培养。在第0天以10ng/ml的浓度添加tgfβ1，并在第7天通过流式细胞术细胞毒性读出。[0949]体外重新刺激测定[0950]将car‑t细胞与supt1‑psma高或supt1‑psma低靶细胞以1:1比率(e:t)共培养。每7天用5×104个supt1细胞重新刺激car‑t细胞。如上所述，通过fbk测定评估细胞毒性，并通过细胞荧光分析法追溯重新刺激后效应与靶标比率。收集上清液以评估细胞因子释放。[0951]细胞因子elisa[0952]使用人il‑2elisa maxtmdeluxe和人ifn‑γelisa maxtmdeluxe试剂盒来评估分泌到从细胞毒性测定中取得的共培养上清液中的细胞因子的水平。[0953]体内实验[0954]将5×106个psma阳性pc3人细胞系注射到雌性nsg小鼠的侧腹。让异种移植物建立3周，直至通过触诊和卡尺测量可检测到稳定的植入。通过单一、双重或三重转导创建人pbmc。以1×106个car t细胞/小鼠的剂量i.v.施用car t细胞。每周进行2/3次卡尺测量，并随访至动物方案结束。[0955]以上说明书中提到的所有出版物通过引用并入本文中。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于此类具体实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求的范围内。