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医学遗传学
　　第二节　基因突变检测的基本技术

　　基因诊断选择不同的技术，直接检测和分析样本中的DNA或RNA水平上的致病性突变，以协助遗传病的诊断、产前诊断、分类、预后和药物治疗等（表2-1）。样本只要包含任何有核细胞即可，包括外周血（最常用）、活检标本、羊水、绒毛、口腔黏膜、石蜡组织块、唾液、痰液、尿液、精液、毛囊等（详见“第三章遗传病诊断与遗传咨询”）。

　　表2-1　DNA突变检测技术一览

　　续表

　　一、直接检测DNA突变的技术

　　（一）PCR

　　聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是最基本、最为广泛应用的DNA突变检测技术。PCR可以选择性地将单个DNA或RNA分子在几小时内迅速扩增至几百万倍以上，直接检测和分析患者特定基因的序列而不需要克隆及DNA印迹或RNA印迹分析的过程。从发根、漱口液及少量血痕中得来的极少数细胞均可以直接用于PCR分析，因而可以不必从组织中抽提大量的DNA或RNA样本。

　　PCR的原理是用一对能分别与靶DNA双链序列配对的人工合成的寡聚核苷酸引物，在耐热DNA聚合酶（Taq）的作用下扩增目的DNA片段（图2-8）。重复热变性、引物复性及延伸的循环，靶序列的拷贝数会按指数成倍增长（可达106～7）。

　　PCR的操作流程如下：

　　（1）用加样器在Eppendorf反应管中加入下列成分：PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、引物混合液、基因组DNA模板、ddH2O。

　　（2）在设定好的PCR仪上进行反应：95℃变性3分钟（第一轮循环）；95℃变性30秒；56℃复性30秒；72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟（最后一轮循环）。循环反应30轮（注意：复性的温度和时间依据靶DNA序列的长度和引物序列的不同而异）。

　　（3）反应结束后，取少许反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认是否有目的PCR产物。另外，DNA染色后，可将PCR产物条带的浓度同分子量标志（marker）条带的浓度进行比较，估算大致的DNA量。

　　图2-8　PCR的基本原理示意图

　　PCR技术有快速、经济、灵敏度高以及对患者核酸检测的样本的要求低等很多优势。但由于PCR的强大扩增能力与检测的敏感性，极微量的污染便可导致假阳性结果。因此，临床实验室要特别重视避免PCR的产物被污染。

　　（二）实时定量PCR（qPCR）

　　自Mullis于1985年发明PCR技术以来，已经衍生出几十种相关的PCR方法，如多重PCR、原位PCR、RT-PCR、巢式PCR等。定量PCR的目的是以PCR终产物的量推测样本中待测靶分子的起始量和相对起始量，即检测样本中靶基因的拷贝数，故对研究基因的扩增和表达，以及疾病的预后具有重要意义。其中，又以实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）的应用最为广泛。根据所用荧光技术的不同，qPCR可分为两类：①根据寡核苷酸探针与PCR产物结合后所释放出的荧光进行检测和定量，如TaqMan系统；②通过双链DNA亲和性荧光素与PCR产物结合后所释放出的荧光进行检测和定量，如SYBR Green系统。

　　PCR反应的早期，每经过一轮变性、引物复性和延伸合成的周期，DNA分子的数量就会增加一倍。如果对这种相关性进行绘图，在半对数坐标纸上可以得到一个直线图形。达到一定的产量阈值（threshold）所需的PCR循环数是估测PCR起始模板数量的一个反映：达到一定产量所需的循环数越少，起始PCR的模板量越多。qPCR是相对于一个标本（内参照标本B）的待测标本（标本A）中特定DNA或RNA的定量分析，标本A与B扩增的效率应该具有可比性；即两条直线区段应该是平行的。以TaqMan方法为例，与普通PCR不同，除了含有2条普通的PCR引物之外，还有1条荧光标记的基因探针。探针的5′-端标记荧光报告基团（R），3′-端为荧光淬灭基团（Q）。当探针保持完整时，Q基团抑制R基团，无荧光信号。在PCR反应中，Taq耐热DNA聚合酶不仅具有延伸DNA引物的活性，而且具有5′→3′外切核酸酶的活性。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其外切酶活性将探针切断，R基团远离Q基团，Q基团的抑制作用消失，其能量不能被吸收，R基团的荧光信号便可被测到，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，通过检测荧光信号的强度就可推算出PCR产物的量（图2-9）。

　　图2-9　qPCR的原理

　　A.TaqMan技术；B.real-time PCR分析结果。随着PCR循环次数（X轴）的增加，PCR产物（Y轴，以荧光强度表示。Rn即校正后的报告基团荧光强度）呈指数性增长

　　（三）限制性片段长度多态性（RFLP）

　　限制性内切酶（restriction endonuclease）简称“限制酶”，是能识别特定的DNA双链序列并能在识别序列或其邻近处进行双链切割的酶。如Eco RⅠ、Bam HⅠ、HaeⅢ等。限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是由于DNA序列的变异所引起的限制性酶切位点的改变，从而导致酶切片段大小的差异。这些片段在不同的个体中存在差异，并在人群中表现遗传多态现象。这是由于人类基因组中存在着大量单个碱基置换的中立突变以及某些重复序列的重复数目在不同个体中的差异造成的（图2-10）。

　　图2-10　限制性片段长度多态性（RFLP）以及DNA杂交的检测结果

　　在家系中用RFLP的连锁分析进行基因诊断，就是利用家族中突变基因与某个限制酶切片段或位点的多态性紧密连锁的特点进行的。

　　（四）DNA印迹

　　欲对特定基因中的DNA片段进行分析，首先必须把细胞或组织标本中的目标DNA片段与其他大量的DNA片段区分开来。用限制酶酶切人类基因组，可产生几百万条DNA片段，关键是如何从这些错综复杂的片段中找出所要鉴定的目标DNA片段。解决问题的方法是用凝胶电泳将DNA片段按大小进行分离，然后再用探针进行核酸杂交，以确定目标分子片段。DNA印迹（Southern blotting）就是将变性DNA从电泳凝胶中转移到纤维素膜等固相介质上，然后进行DNA杂交的操作过程（图2-10、图2-11）。

　　图2-11　DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹的流程

　　首先是纯化样本的基因组DNA。人体内除成熟的红细胞（无细胞核）外，几乎所有细胞均可以作为DNA的来源。常用的如从患者白细胞中分离的基因组DNA，10ml外周血可以得到50～100μg的DNA，足够做10～20次限制酶的消化。基因组DNA样本还可以从其他组织中分离到，如培养的皮肤成纤维细胞等，用于产前诊断的羊水或绒毛膜绒毛，任何活检组织（如肝脏、肾及胎盘等）。基因组DNA经限制酶消化后产生的约100万个DNA片段用琼脂糖凝胶电泳分离，小的DNA片段泳动快而大的片段泳动慢。当用DNA的荧光染料（如溴化乙锭）染色时，基因组DNA片段由于太多而呈现模糊的一片。当双链DNA被一种强碱变性而分成两条互补的单链后，单链DNA通过印迹作用（blotting）和毛细管作用从凝胶转移到了硝酸纤维膜或尼龙膜上。为定性膜上数百万个片段中的目的片段，标记的DNA探针经变性成单链状态后与膜在液相中进行分子杂交。探针只与它的互补链进行复性或退火。如果探针为克隆的一段基因组DNA，它常常因切割DNA所用的酶而只与膜上的1个或2个片段杂交。如果探针为一段克隆的cDNA，那么就会有相对多的片段与探针杂交。这是由于基因组样本中的基因往往是不连续分布的，即为割裂基因的缘故。杂交后的膜要洗去那些未结合的探针，然后将膜（膜上已有被杂交上的标有放射性的探针）与X线片压在一起进行曝光，这样X线片上将出现已被杂交的片段位置，这个位置完全对应于一开始做琼脂糖凝胶电泳时不同样本的片段位置。

　　（五）RNA印迹

　　对应于DNA印迹，RNA印迹（Northern blotting）被用于确定RNA样本中特定基因转录的mRNA分子的大小及量的信息。RNA虽然不像DNA分析那样用限制酶切割，但不同基因的转录物的长度是不同的。因此，一种细胞的总RNA或纯化的mRNA可以用琼脂糖凝胶电泳按分子大小分开被转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上。如同DNA杂交中的步骤，将膜与已标有放射性、变性的探针温育杂交。洗膜并与X线片压片曝光，将会出现一个或多个目的转录物的条带（图 2-11）。

　　（六）蛋白质印迹

　　分析DNA和RNA的Southern blotting及Northern blotting技术建立以后，检测特定蛋白质的方法也就被称为“Western blotting”。本法可用于检测从遗传病患者的细胞中提取的突变蛋白的分子大小及量的多少。把从细胞中抽提的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），按相对分子质量大小使不同蛋白质分离并把它们经印迹转移到一张硝酸纤维素膜、尼龙膜或化学活化膜上，然后将膜与目的蛋白的抗血清一起温育。这种抗原抗体之间的结合可以被标有组织化学、荧光或放射性物质的针对第一抗体的第二抗体所识别。蛋白质印迹具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优势，因而该技术被广泛地用于蛋白质研究、基础医学和临床医学研究（图2-11）。

　　（七）Sanger测序法

　　DNA序列信息对预测基因编码的氨基酸序列、检测遗传病的基因突变以及设计分子诊断用的ASO探针和PCR引物等至关重要。DNA序列测定是诊断已知和未知基因突变最直接、可靠的方法。经典的DNA测序技术称为Sanger测序法（Sanger sequencing，以英国著名科学家、两次诺贝尔奖获得者Fred Sanger命名），是基因诊断的“金标准”。Sanger测序法可用于点突变、小缺失和小插入等的检测。

　　任何纯化了的DNA片段都能够测序，无论是克隆片段还是PCR产物。Sanger测序法利用了4个双脱氧核苷酸（ddA、ddC、ddG和ddT），它们的脱氧核糖缺少3′-羟基（通常 DNA缺少2′-羟基）。如果加入到正在延伸的DNA链中，双脱氧核苷酸将阻止DNA聚合酶结合到与被测序的模板链互补的下一个碱基，因而阻断DNA的延伸。在Sanger测序中，被测序的DNA片段作为模板，一段短寡核苷酸引物结合上去，DNA聚合酶沿着模板序列不断延伸引物，插入核苷酸，进行DNA合成。为了得到序列信息，先把双脱氧核苷酸和正常的4种脱氧核苷酸一并加入到延伸反应中去，每一种双脱氧核苷酸标记有可发出不同荧光的荧光染料。聚合酶会选择任一正常核苷酸加入而继续延伸合成链，或选择双脱氧核苷酸而终止合成链。终止的链被电泳分离，终止点的双脱氧核苷酸由特定的荧光标记识别（图2-12）。

　　图2-12　使用荧光引物进行Sanger测序的DNA自动测序仪原理

　　A.4种荧光染料用于标记特异的碱基反应。荧光标记可通过附着一个特异的碱基ddNTP或引物上而被嵌合，4套引物对应于4种反应。包含全部4种碱基测序反应混合物的样本经PAGE电泳而分离为大小不一的片段。B.当各个片段进行电泳迁移时，激光束聚焦在凝胶的一个特定位置上。单个DNA片段通过这个位置时，激光束就会引发荧光。4种染料在不同的波长下发出最强的荧光，信息被电子化记录下来，再将解译的DNA序列储存到计算机数据库里。C.一段DNA序列（PHC3基因的cDNA）的测序结果图像。4种碱基的荧光颜色分别为：A绿色、T橘黄色、C蓝色、G红色

　　DNA自动测序仪不仅在人类基因组计划测定长达31亿碱基对的人基因组DNA序列中扮演了主角，也早已被用来测序其他生物医学上重要的物种，包括E.coli和其他病原菌、酵母菌（Saccbaromyces cerevisiae）、疟原虫、秀丽线虫（Caenorbabditis elegans）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、多种鱼类、鸡、大鼠、小鼠、黑猩猩，以及许多在进化树中占据重要角色的物种。

　　（八）高通量测序技术

　　高通量测序（high-throughput sequencing）又称二代测序（next generation sequencing，NGS）或大规模平行测序（massively parallel sequencing）技术，对应于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而得名。在二代测序中，三种主流测序技术分别为依次出现的Roche/454焦磷酸测序（2005年）、Illumina/Solexa聚合酶合成测序（2006年）和ABI/SOLiD连接酶测序（2007年）。高通量测序可检测整个基因组存在的点突变、小插缺等，与Sanger测序相比，最突出的特征是单次运行产出序列数据量巨大。

　　高通量测序技术一般由模板准备、测序和成像、序列组装和比对等部分组成。三种高通量测序技术的原理各不相同，其数据量产出、数据质量和单次运行的成本也有差异。高通量测序的出现，使得获得核酸序列数据的单碱基测序费用相对于Sanger测序急剧下降，随之也给基因组学研究带来了更多的新方法和新方案。目前，高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、基因组重测序、外显子组测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测序等方面，并在孟德尔疾病和复杂疾病的研究以及疾病的基因诊断中发挥重要作用（图2-13）。

　　图2-13　应用外显子组测序寻找致病基因和突变的策略

　　（九）等位基因特异性寡核苷酸（ASO）

　　对于某些遗传疾病来说，相当一部分病例是由相同的单个或几个碱基突变引起的。有时，由于家系中已检测出一种不常见的基因突变，则要求其他成员也进行筛查。在这种情况下，应该重点分析突变DNA位点，看这个特异的突变是否存在于患者中。检测单碱基或几个碱基的突变或小插入、缺失突变的最佳探针是合成的寡核苷酸。其长度短，灵敏度高，甚至可以精确到探针和标本之间单个碱基的错配。因此，人工合成的正常序列的寡核苷酸探针——等位基因特异性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO）在与正常个体的DNA序列进行杂交时，只能与正常的互补序列精确配对杂交，而不能与靶序列中出现的一个或几个错配碱基进行杂交（图2-14）。与此相似，根据突变序列合成的ASO，只能与突变的互补序列进行杂交，不能与正常的基因序列进行配对。

　　ASO用于检测已知的点突变。ASO与传统的DNA印迹法的重要区别在于所用的DNA探针不同。大多数情况下，用标准的克隆DNA探针做DNA杂交，无法区分正常基因与单碱基突变或小突变（如小片段缺失或插入）的DNA序列。只有用短ASO探针才能够探查单核苷酸突变。

　　图2-14　ASO探针检测β-珠蛋白基因单碱基突变导致的镰状细胞贫血

　　左上：正常βA探针只与相同序列的DNA序列配对。右下：突变βS探针只与携带镰状细胞血红蛋白基因突变的序列配对，突变序列与正常序列只相差一个碱基。每个序列的下方是每个标记探针和所有3种基因型DNA样本的杂交图，显示3种不同基因型的杂交强度

　　不管个体的两条同源染色体上是否携带相同的正常或异常DNA序列，或一条染色体为正常另一条染色体为异常，ASO都可准确区分个体间特定的单个DNA序列。但是，必须谨慎分析ASO的检测结果，因为同一基因座的突变可能并非同样的序列改变。因此，若杂交结果为阴性，不一定表明患者的整个基因序列没有突变，可能在该突变基因的其他位点上存在ASO无法检测出的突变。

　　（十）三引物PCR（TP-PCR）

　　三引物PCR（tri-primer PCR，TP-PCR）可用于检测三核苷酸重复突变。例如，脆性X综合征（fragile X syndrome）［OMIM 309550］是最常见的遗传性智力低下疾病之一，发病率仅次于Down综合征。患者FMR1基因的5′端非翻译区（5′-UTR）有遗传不稳定性的（CGG）n三核苷酸重复序列，伴有CpG岛异常甲基化；几乎所有患者FMR1基因的mRNA及其蛋白产物不表达或低表达。根据（CGG）n重复程度可把突变分为以下几种类型：①前突变（pre-mutation），见于正常男、女传递者，（CGG）n重复为52～200个拷贝，无CpG岛甲基化，各种体细胞中基因改变一致（无体细胞异质性）；②全突变（fullmutation），见于男、女性患者和部分女性携带者，（CGG）n重复拷贝数大于200，CpG岛完全或高度甲基化，存在广泛的体细胞异质性；③嵌合型（mosaicism），属于中间类型，约占基因突变类型的15%，具有前突变与全突变的基因带型以及较低程度的CpG岛甲基化和体细胞不稳定性。用TP-PCR可快速进行FMR1基因（CGG）n重复的定性检测，使得各种大小不一的序列在TP-PCR反应中被扩增出来。其优势包括：①定性检测（CGG）n重复的扩增；②可区分扩增了的等位基因和正常的等位基因；③可分辨正常纯合子和有扩增的杂合子女性样本；④支持高通量检测，且一天内即可出检测报告。

　　如果（CGG）n重复的数目增加，则一个明显的PCR产物轮廓（梯形轮廓）会在电泳图谱中出现。样本中只要含有一个扩增的片段就会产生一个能跨过检测所设置的阈值的PCR产物轮廓（梯形轮廓）。这个特异的梯形轮廓可被用于快速鉴别样本为正常、前突变或全突变，无论样本是1个还是2个等位基因存在突变。但TP-PCR无法检测出等位基因中（CGG）n的重复次数。如图2-15所示，一个（CGG）55重复的阈值被指定出来（检测时自行设置），以区分正常个体和非正常个体。含有扩增序列的等位基因的梯形轮廓会跨过阈值。因此，TP-PCR法可快速建立基于PCR方法的脆性X综合征筛查。

　　图2-15　脆性X综合征FMR1基因（CGG）n重复的TP-PCR定性检测图

　　（十一）多重连接依赖式探针扩增（MLPA）

　　多重连接依赖式探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术是一种高通量、针对待测DNA靶序列进行定性和半定量分析的方法，具有高效、特异、在一次反应管中可同时检测多个不同的核苷酸序列拷贝数变化的优势，可用于检测大缺失、重复。MLPA的基本实验流程和原理包括DNA变性、探针与DNA靶序列杂交、连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离，最后经软件分析获得结论（图2-16）。

　　每对MLPA探针包括两段寡核苷酸序列，每条探针包括一段引物序列和一段特异性序列。通过与靶序列的杂交，并使用连接酶把两部分探针连接成1条核苷酸单链，再通过通用引物进行扩增。由于设计的每对探针所扩增的产物长度不一，毛细管电泳可将PCR产物的不同片段进行分离，最后应用Genemarker等软件对结果进行分析。如果检测的靶序列发生点突变、甲基化、缺失、扩增突变，则相应探针的扩增峰便会发生缺失、降低或升高。因此，根据扩增产物的改变，可判定靶序列是否存在拷贝数目的异常、点突变和甲基化现象。

　　二、DNA突变的预筛查技术

　　筛查未知基因突变的技术可以分为以下几类：

　　（1）基于突变型和野生型片段单链在凝胶电泳上迁移率的不同或指纹图谱差异的检测，最典型的是单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP）、双脱氧指纹法（dideoxy fingerprinting，ddF）和限制性内切酶指纹法（restriction endonuclease fingerprinting，REF）等。

　　图2-16　MLPA的实验流程

　　（2）基于突变型和野生型片段生成的杂合双链体与纯合双链体在PAGE上迁移率不同的 检测，包括变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、构象敏感凝胶电泳（conformation-sensitive gel electrophoresis，CSGE）和异源双链分析（heteroduplexes analysis，HA）等。

　　（3）基于杂合双链体和纯合双链体在高效液相色谱中滞留时间的差异的筛查方法，即变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）分析。

　　（4）基于杂合双链体中错配碱基的化学断裂法（chemical cleavage of mismatch，CCM），如用RNase、DNA修复酶或化学试剂（四氧化锇、羟胺）的检测。上述检测方法在灵敏度、适用范围和检测突变类型上存在差异，各有优势和不足。

　　（一）变性高效液相色谱（DHPLC）

　　DHPLC用于DNA序列变异检测的本质是用离子对反相HPLC进行DNA杂合双链片段分析。假定突变类型为单个碱基的替代突变，其检测原理如下：当野生型DNA片段（Wt/W t′，分别表示正义链和反义链）和突变型DNA片段（Mut/Mut′，分别表示正义链和反义链）等量混合（若为杂合突变，PCR产物中既包含野生型，又包含突变型DNA片段），95℃加热使之完全变性后缓慢冷却、复性，形成 4 种 DNA 片段：Wt/Wt′、Mut/Mut′、Wt/Mut′和 Mut/Wt′。 前两种为纯合双链DNA片段，后两种为杂合双链DNA片段。这4种DNA片段在非变性温度下（如50℃）洗脱时仅表现出单峰。但是，当洗脱温度升高时，纯合双链和杂合双链DNA片段部分解链，由于杂合双链DNA片段在突变位点有不配对的碱基（错配碱基），它们的部分解链程度要大于纯合双链DNA片段，相应地与基质颗粒的结合作用小，在基质中的滞留时间短。这样，DHPLC就可以依据杂合双链和纯合双链DNA片段滞留时间的不同，将它们区分开。在理想状态下，DHPLC的洗脱图中可出现4个峰，先洗脱的2个峰各自代表2种杂合双链DNA片段中的一种，后洗脱的2个峰分别代表2种纯合双链DNA片段中的一种。实际上，由于DHPLC的分辨率，最适的部分变性洗脱温度的选择，突变类型以及周围的碱基组成等原因，DHPLC往往只出现2个洗脱峰，滞留时间短的1个峰为2种杂合双链DNA片段的混合物，滞留时间长的1个峰则为2种纯合双链DNA片段的混合物。因此，仅从样本DHPLC洗脱峰型的变化，可以判断样本是否存在突变（图2-17）。

　　图2-17　4个呈常染色体显性遗传的表皮松解性掌跖角化症家系的部分成员的KRT9基因第1外显子PCR扩增产物在WAVE系统进行DHPLC分析（60.3℃）的色谱图

　　右框内的数字表示样本代号。患者有2个洗脱峰，正常个体（F1-Ⅲ-6）仅有1个峰

　　与其他基因突变预筛查技术相比，DHPLC具有以下明显的优势：①灵敏度高。突变检出率超过96%，检测的DNA片段最大可达1500bp。②结果重复性好，几乎没有假阳性。③快速、方便、自动化且费用低廉。一个样本的分析仅需10分钟左右，同时免去了灌胶和电泳等繁琐和耗时过程，节省了大量的人力和时间。因此，可用DHPLC进行快速的基因分型和基因突变筛查，实现大规模和高通量的分析。④回收的DNA片段可直接用于PCR反应、DNA测序以及作为目的片段克隆到载体中。⑤安全、可靠，避免了放射性照射和化学物质对人体造成的损伤。

　　（二）高分辨率熔解曲线分析（HRM）

　　高分辨率熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HRM）实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合信息。SNP位点因不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同的SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因而HRM分析能够有效区分不同的SNP位点与基因型。

　　以LightScanner为例，其检测的样本为PCR产物，依据杂合异源双链的原理或不同样本DNA双链的Tm值差异的原理。在PCR反应前加入LCGreen饱和荧光染料（LCGreen荧光染料只结合DNA双链，对PCR不会有任何抑制作用），然后将PCR产物（96/384孔板）直接放入LightScanner进行熔解，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时LC Green荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，96孔板中的每一个孔里的荧光信号均下降。

　　如果某个个体携带杂合突变，则在其PCR产物中会有杂合异源双链的存在，在杂合异源双链中有不配对的碱基对，因而该样本在温度逐渐升高的时候会首先发生解链，其荧光信号首先开始下降，而此时的纯合子个体的样本由于解链温度较高，荧光信号没有下降或下降较慢，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变，软件自动分型（图2-18）。

　　图2-18　HRM高分辨率熔解曲线示意图

　　不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状

　　LightScanner高分辨率熔解曲线法可用于：①样本中特定突变位点SNP（包括缺失、重复）的筛查，基因突变扫描；②特定突变的筛查、未知突变的发现；③尤其适用于体细胞样本中低突变比例DNA的突变检测；④HLA基因配型、等位基因频率分析；⑤甲基化研究；⑥法医学鉴定、亲子鉴定；⑦STR、SSR分析等。

　　三、间接检测DNA突变的技术

　　对某种遗传病进行基因诊断时，要视该病的基因是否已克隆、基因的大小、人群中突变基因的结构及目的基因旁边是否存在有价值的多态性遗传标记而区别对待。一般将基因诊断的方法分为直接法和间接法两大类。直接法如上所述，主要是直接对致病基因进行诊断和分析，检查其是否存在结构异常。而间接分析法主要是用基因旁边或内部的遗传多态标记在家系中作连锁分析而进行基因诊断，主要是用多态性位点来跟踪致病基因的传递（详见“第三章遗传病诊断与遗传咨询”）。间接检测DNA突变的技术一般在下述情况下采用：①致病基因还未得到完全克隆；②患者的家系资料较为完整；③已知与致病基因紧密连锁的DNA多态性位点。

　　（一）短串联重复序列连锁分析

　　短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称微卫星DNA（microsatellite DNA），是遍布于人基因组中的高度重复序列，重复单位一般为2～6bp。在人群中因重复次数不同而存在遗传多态性，它的杂合度和所含信息都比较高，因而可应用于未知致病基因的遗传病诊断，或作为直接检测DNA突变的验证方法之一。

　　图2-19　用一种与某显性遗传病基因连锁的STR重复多态性进行基因诊断

　　A.家系系谱；B.系谱中各家系成员目的基因与其侧翼的STR的连锁图谱。图中的数字表示STR二核苷酸重复的数目

　　图2-19显示了用STR多态连锁分析作出基因诊断的原理，分析显示有24个重复单位的STR与突变基因D连锁，再次妊娠或在症状前就可以以此STR为标志作出诊断。

　　在用STR作连锁分析进行基因诊断时，发生错误诊断的概率大小与突变基因与多态遗传标记间的重组有关。

　　（二）DNA指纹

　　长10～100bp的DNA高度重复序列（重复次数通常为几百至几千次）称为小卫星DNA（minisatellite DNA）。由于小卫星可变的串联重复次数造成许多等位基因，故又称为可变数目串联重复（variable number of tandem repeat，VNTR）。这种信息量最大的多态性标记涉及几十个或以上的等位基因，因而两个无亲缘关系的个体之间不可能共享等位基因。无论是STR还是VNTR，大部分可能对健康无影响，但有些VNTR会引发相关疾病。

　　许多不同的VNTR的小卫星重复序列很相似，故在一次DNA印迹杂交中，使用一种小卫星片段探针即可同时检测多个基因座。只有同卵双生子才有相同的杂交图谱（图2-20）。因此，这是用于法医身份验证的DNA指纹（DNA fingerprint）的首选。DNA指纹仅用于法医学，而不用于疾病的基因诊断。

　　图2-20　通过探针检测基因组众多基因座的VNTR多态性，从而确定孪生子的DNA指纹

　　每对泳道都是一对孪生子的DNA。第一对和第三对孪生子的DNA指纹相同，表明他们为同卵双生子。中间一对孪生子的DNA指纹明显不同，表明他们为二卵双生子

　　不过，用DNA印迹检测VNTR已经过时，目前一般都用PCR检测STR。例如，近年来，美国FBI用13个STR标记作DNA指纹数据库。两个个体之间（除了同卵双生子）的13个STR的基因型不可能全部相同，故再结合数据库，便可以鉴定不同样本是否来自同一个体。