化学里的aq表示什么_化学反应中Q是什么

一种毕赤酵母基因工程菌的构建及其在提高甲醇同化率及固定二氧化碳的上应用 　　
1.本发明属于菌株代谢改造领域，具体涉及一种毕赤酵母基因工程菌的构建及其在提高甲醇同化率及固定二氧化碳的上应用。背景技术：2.全球粮食短缺促使人们寻找用于生物燃料或化学品生产的替代原材料来源。甲醇是一种非粮食来源的c1原料，由于其低价格和能量含量高，正在成为工业生物制造的一种有吸引力的替代品。甲醇可以很容易地从煤炭、天然气或其他可再生资源中生产出来，全球年生产能力超过1亿吨。近年来，通过co2加氢合成甲醇的技术取得了突破。甲醇生物制造的发展是建立可持续循环碳经济的关键因素。3.甲基营养菌是能够在甲醇上生长，并以甲醇提供碳源和能源的微生物，这两种物质都是甲醇生物制造所必需的。许多天然的甲基营养菌，如甲烷杆菌和甲醇芽孢杆菌，最近被鉴定并用于生产单细胞蛋白质、phb或氨基酸。此外，一些模式生物，如大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒杆菌，也被设计用于甲醇同化。其中毕赤酵母（p.pastoris）被重新分类为komagatella phaffii，是甲基营养酵母的代表。与细菌甲基营养菌相比，毕赤酵母在甲醇培养基上生长更快。巴斯德酵母菌在最小培养基中的高细胞密度发酵很容易实现，并且已经建立了由甲醇严格控制的各种发酵策略。4.所有这些特征意味着，与其他具有代表性的甲基营养体相比毕赤酵母具有更大的大规模工业用途潜力。一些由毕赤酵母生产的生物制药或蛋白质已经上市。但是毕赤酵母的甲醇利用率较低，大部分的碳流量经过异化途径生成co2流失， 此外甲醇的同化途径中的能量被限制在xump循环中不能完全用于产品生成。说明毕赤酵母是一种甲醇利用效率较低的底盘细胞。技术实现要素：5.针对毕赤酵母对甲醇利用效率低的问题，本发明提供了一种毕赤酵母基因工程菌的构建及其在提高甲醇同化率及固定二氧化碳的上应用，不仅能解决碳原子浪费问题，而且赋予毕赤酵母固碳及碳原子再利用能力进一步提高碳原子的利用效率。6.一种毕赤酵母基因工程菌的构建，包括以下步骤：步骤1，分别设计还原性甘氨酸途径相关基因mis1、还原性甘氨酸途径相关基因gcv1、还原性甘氨酸途径相关基因gcv2、还原性甘氨酸途径相关基因gcv3对应的引物，利用pcr扩增引物各自对应的序列，重组质粒中所用的mis1、gcv1、gcv2、gcv3均来自于毕赤酵母gs115内源性基因；步骤2，利用crispr-cas9基因敲除技术在毕赤酵母中敲除异化途径中fdh基因，获得重组菌株gs115-δfdh；步骤3，构建重组质粒pgap-mis1-p2a-gcv1、pgap-gcv2-p2a-gcv3，以及敲除质粒pet28a-his；步骤4，将重组质粒pgap-mis1-p2a-gcv1、pgap-gcv2-p2a-gcv3导入毕赤酵母gs115-δfdh中，并利用敲除质粒pet28a-his进行双交叉同源重组敲除毕赤酵母中das基因，实现还原性甘氨酸途径替换原有的甲醇同化途径；步骤5, 构建重组质粒pic9k-fld-p2a-fgh-pts1，将毕赤酵母gs115甲醇异化途径fld、fgh基因利用特异性引物进行pcr扩增，并在序列c端添加pts1信号肽将异化途径定位于过氧化酶体中；步骤6，将重组质粒pic9k-fld-p2a-fgh-pts1导入步骤4构建的重组毕赤酵母中，实现对毕赤酵母甲醇异化途径区室化定位表达，得到含有重组质粒的毕赤酵母pichia pastoris.，简称重组菌。7.作为改进的是，步骤1中还原性甘氨酸途径相关基因mis1所用的上游引物为mis1-f的核酸序列如seq id no .17所示，下游引物mis1-r的核酸序列为seq id no .18所示；还原性甘氨酸途径相关基因gcv1所用的上游引物gcv1-f的核酸序列如seq id no .7所示，下游引物gcv1-r的核酸序列如seq id no .8所示，还原性甘氨酸途径相关基因gcv2所用的上游引物gvc2-f的核酸序列如seq id no .9所示，下游引物gvc 2-r的核酸序列如seq id no .10所示，还原性甘氨酸途径相关基因gcv3所用的上游引物的核酸序列如seq id no .11所示，下游引物gcv3-r的核酸序列如seq id no.12所示。8.seq id no .5:tatttcgaaacgaggaattgaaacgatgctttcaagaattggatctagaaataaag；seq id no .6：acgtctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggcaaataa；seq id no .7：taaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacga；seq id no .8：agatgagtttttgttctagtcactccggcttataaaatttgggggc；seq id no .9:tatttcgaaacgaggaattgaaacgatgttaagaacccagttctcca；seq id no .10：tctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggcttgactagca；seq id no .11：tgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacga；seq id no .12：atgatgatgatgatggtcgattagctttcctcctgcaaaaacttgac。9.作为改进的是，步骤1中所述pcr扩增所用的条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。10.作为改进的是，步骤3中构建重组质粒pgap-mis1-p2a-gcv1所用的还原性甘氨酸途径相关基因mis1的氨基酸序列如seq id no .1所示，还原性甘氨酸途径相关基因gcv1的氨基酸序列如seq id no .2所示。11.seq id no .1mlsrigsrskatstvrrlagdlllgsrklhasavfsqaqilsgtklaksirskvfeeinvfkathpefqpavtiiqvgdrpdssayvrmklkaasesgiicnviklpedtaeptlinrihklnndnsvhgilvqlplpshidethitnsvsilkdvdgfdrfnvgelakkggnptflpctpngcmklleasgvelsgksavvlgrsdivgtpvaqllnkanctvtvchsrtpniaeivknsdivvaaigkanfvkgewlkpgavvidvginyvpdptkksgqrlvgdvefesakekasvitpvpggvgpmtvamlvsniahaaklqlendlkpakiyanplelktpvpsdieisraqepryikdiatdlgikdkelelyghykakvsldvydrlaknrengnyvlvagitptplgegkstttmglvqalgahlnlaavanvrqpsmgptfgvkggaagggyaqvipmdefnmhltgdihaigaannllaaaldtrifhettqrdaifykrlvpakkgvrkftpsmlkrleklginktepdsltpeeatkfaklnidpqtitvkrvldvndrfvrqvtigeaptekghirktgfditvasevmailalskdlkdlrsrvgaivvassyegvpitaedlgvagaltallkdavkpnlmqtlegtpvfvhagpfanisigassviadrvalkligasksdvvaksekgfvvteagfdftmggerfynikcrasglkpntvvlvatsralklhggapdvkpgqalpeeyttenvelvrrgcanlakqisnasqygapvvvainqfetdspaelsvireealkagafdavpsnhwaeggkgavelakavvsscascpepnaekaelyslenntiedrlntivqkmyngdgielselakeqiaryeaqgfgnlpiciaktqyslshdpslknvpagftvpirevrlsagagylsclaaeimtipglpthpgylnvevnddgeieglfseq id no .2mirscrrystgvealiktplysvhvehgatlvpyanfampvlykgqshieshnwtrskvgifdvshmlqhrvkgnsaaeflqkitpsdlkalkpftstlsvllndkggviddciitkhdenefyivtnagcrdkdtsfikeeisqfgnashenfegtllaiqgpqaaetlqkftnldltklyfgnsafaklegftsdvihiarsgytgedgfelsipvdsegleftkalleleqvkpiglaardslrleagmclyghelneqttpvesslnwliaksrrtpktagfngsenilsqlenpksvtfkrvgiqskgpspregnkvysfeepdkqigvvcsgspsptlggnvgqafihkphqkagtkilieirnkkreahvaklpfvapkfykpe作为改进的是，步骤2中构建重组质粒pgap-gcv2-p2a-gcv3所用的还原性甘氨酸途径相关基因gcv2的氨基酸序列如seq id no .3所示，还原性甘氨酸途径相关基因gcv3的氨基酸序列如seq id no .4所示。12.seq id no .3mlrtqlskallkshsvkawarvgtattsrfvsdttsatfrsiyekgsstpspydgtdsfprrhlgptpnnvdemlqdlkesdldsfiakvvpdnvlirrslkveplkgftesemlaelariaekndlvkpligkgfygtiippvilrnllenpgwytsytpyqpevsqgrlesllnfqtvisdltglpvanaslldessaaaeamilsftslkskkpkyfvdsniheqtlavlksrahtlsievvvadlttdegfaalqenkdqlcgamvqypatdgsietfkaysriaelvhsvkglyavasdlmaltllhapskfgadivfgssqrfgvplgyggphaaffsvveslqrkipgrivgvskdrlgnnalrlalqtreqhikreratsnictaqallaniaanyvvyhgieglrniskrihgfttllansinessshkvlnekwfdtlsvdvgsadefiakalsknfnvfrvnnstiqlsldetvtknelttlislftgssevnlpetlpsfyeewtrqddiltnevfrthrsetsmlrylthlqkkdisladsmislgsctmklnatvemmpiswpkfanihpfapkdqvkgytelivelekdladitgfhsttlqpnsgaqgeytglsviakyfeskgeahrnivlipvsahgtnpasaamaglkvvpikclkdgsldlqdleskaskhaknlaammvtypstyglfepgiidaikiihnhggqvyldganmnaqvgltspgdlgadvchlnlhktfaiphggggpgvgpicvkehltpflpshpiiattnqteqsinpvvaapfgsasilpisyayikmmggsnlqyssiiailnanymvaklknhfeilftggdakycghefiidlrpfkkfgieaidvakrlqdygfhaptmsfpipgtlmvepteseykeeldrfidsmisireeirkvengetdgailhnsphnlkdiistsdaewsqrgytreeaayplpflkeqktwptvsrvddtygdmnllctcpsveevaasqseq id no .4mlrtqlskallkshsvkawarvgtattsrfvsdttsatfrsiyekgsstpspydgtdsfprrhlgptpnnvdemlqdlkesdldsfiakvvpdnvlirrslkveplkgftesemlaelariaekndlvkpligkgfygtiippvilrnllenpgwytsytpyqpevsqgrlesllnfqtvisdltglpvanaslldessaaaeamilsftslkskkpkyfvdsniheqtlavlksrahtlsievvvadlttdegfaalqenkdqlcgamvqypatdgsietfkaysriaelvhsvkglyavasdlmaltllhapskfgadivfgssqrfgvplgyggphaaffsvveslqrkipgrivgvskdrlgnnalrlalqtreqhikreratsnictaqallaniaanyvvyhgieglrniskrihgfttllansinessshkvlnekwfdtlsvdvgsadefiakalsknfnvfrvnnstiqlsldetvtknelttlislftgssevnlpetlpsfyeewtrqddiltnevfrthrsetsmlrylthlqkkdisladsmislgsctmklnatvemmpiswpkfanihpfapkdqvkgytelivelekdladitgfhsttlqpnsgaqgeytglsviakyfeskgeahrnivlipvsahgtnpasaamaglkvvpikclkdgsldlqdleskaskhaknlaammvtypstyglfepgiidaikiihnhggqvyldganmnaqvgltspgdlgadvchlnlhktfaiphggggpgvgpicvkehltpflpshpiiattnqteqsinpvvaapfgsasilpisyayikmmggsnlqyssiiailnanymvaklknhfeilftggdakycghefiidlrpfkkfgieaidvakrlqdygfhaptmsfpipgtlmvepteseykeeldrfidsmisireeirkvengetdgailhnsphnlkdiistsdaewsqrgytreeaayplpflkeqktwptvsrvddtygdmnllctcpsveevaasq作为改进的是，步骤5中构建重组质粒pic9k-fld-p2a-fgh-pts1，所用的还原性甘氨酸途径相关基因fgh的氨基酸序列如seq id no .5所示，还原性甘氨酸途径相关基因fld的氨基酸序列如seq id no .6所示；异化途径相关基因fgh所用的上游引物的核酸序列如seq id no.13所示，下游引物fgh-r的核酸序列如seq id no.14所示；异化途径相关基因fld所用的上游引物fld-f的核酸序列如seq id no .15所示，下游引物fld-r的核酸序列如seq id no .16所示。13.seq id no .5mssittsifkvtaeiqsfggklvklqhksdetktdmdvnvylpaqffangakgkslpvllylsgltctpnnasekafwqpyankygfavvfpdtsprglniegehdsydfgsgagfyvdattekwkdnyrmysyvnsellpklqadfpilnfdnisitghsmggygalqlflrnpgkfksvsafspisnptkapwgekcfsgylgqdkstwtqydpteligkyqgpsdssilihvgksdsfyfkdhqllpenflkasensvfkgkvdlnlvdgydhsyyfissftdvhaahhakylglnseq id no .6mstegqiikckaavaweagkdlsieeievlpprahevrvkveftgvchtdaytlsgadaegsfpvvfghegagvvesvgegvesvkvgdsvvllytpecreckfclsgktnlcgkiratqgkgllpdgtsrfrckgkdlfhymgcssfsqytvvadisvvkvqdeapkdktcllgcgvttgygaaintakiskgdkigvfgagciglsviqgavskgaseiividindskkawadqfgatkfvnpttlpegtnivdyliditdggfdytfdctgnvqvmrnaleschkgwgesiiigvaaagkeistrpfqlvtgrvwrgcafggikgrtqmpslvqdyldgkikvdefithrhdldninkafhdmhagnciravitmhseq id no .13：caactaattattcgaaggatccgaaacgatgtcatcaattactacttcaatcttcaagseq id no .14：cacgtctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggccaacttagagtttaaccccaaatactttgcatggtgseq id no .15：tgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacgatgtctaccgaaggtcaagtaagttcaatseq id no .16：aaggcgaattaattcgcggccgcttacaacttagagtgcatagtaatcacagcac作为改进的是，步骤2中所述毕赤酵母gs115来源于商业化菌库，菌种号：atcc。14.上述毕赤酵母基因工程菌在提高甲醇效率及固定二氧化碳上的应用，具体步骤为：第一步，挑选毕赤酵母基因工程菌的阳性克隆，摇床过夜培养后，转接至m9培养基，并以甲醇作为唯一碳源经行培养；第二步，培养细胞过程中，每隔24小时取样绘制生长曲线，以od600衡量，最终测定其生物量。15.有益效果：与现有技术相比，本发明一种毕赤酵母基因工程菌的构建及其在提高甲醇同化率及固定二氧化碳的上应用，对毕赤酵母的甲醇代谢途径进行改造，通过敲除异化途径，并重构还原性甘氨酸途径，从而消除异化生成二氧化碳造成的碳原子流失，提高碳原子利用效率，经代谢改造及区室化设计的菌株对甲醇的利用效率有所提高，并且其可以利用还原性甘氨酸途径固定二氧化碳用于提高生物量。16.具体优势为：1 、本发明中所过表达的还性甘氨酸途径相关基因首次从毕赤酵母中克隆，且成本低廉，分子水平操作简单，易于克隆表达，重复性较好；2、本发明中构建的改造菌株敲除其异化途径，避免了碳流量以co2的形式流失，从而提高了毕赤酵母对甲醇的碳原子利用效率；3、 本发明中构建的改造菌株过表达的还原性甘氨酸途具有固定二氧化碳的能力，从而让毕赤酵母改造成自养型菌株成为可能；4、本发明中构建的区室化重组菌株生物量提高了8.7%，对甲醇同化效率有进一步的提高。附图说明17.图1为本发明中相关质粒图，其中，（a）pgap-mis1-p2a-gcv1；（b）pgap-gcv2-p2a-gcv3，（c）pet28a-his；（d）pic9k-fld-p2a-fgh-pts1；图 2为重组菌株发酵表征，其中（a）敲除das基因菌株发酵验证；（b）fgh-tps1绿色荧光定位;（c）fdh-tps1红色荧光定位; （d）重组菌株发酵验证；（e）发酵菌株甲醇消耗情况（f）发酵菌甲酸积累情况；图 3为相关基因扩增结果；图 4为重组菌株的13c二氧化碳标记。具体实施方式18.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。19.实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的毕赤酵母gs115来源atcc菌种保藏中心、trans1-t1、pxy3、top10等材料都是商业化产品，可直接购买。20.实施例1利用crispr-cas9基因敲除技术在毕赤酵母中敲除异化途径中fdh基因，获得重组菌株gs115-δfdh。21.实施例21、pgapza-mis1-p2a-gcv1重组质粒的构建以具有mis1、gvc1基因的毕赤酵母gs115基因组为模板，通过常规pcr扩增复制对应基因的核苷酸编码序列。22.所用mis1上游引物带有同源臂，序列为：mis1-f:tatttcgaaacgaggaattgaaacgatgctttcaagaattggatctagaaataaagmis1下游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：mis1-r：acgtctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggcaaataa。23.所用gcv1上游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：gcv1-f：taaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacgagcv1下游引物带有同源臂，序列为：gcv1-r：agatgagtttttgttctagtcactccggcttataaaatttgggggc。24.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。25.将回收的片段作为模板加入上引物mis1-f,下引物gcv1-r利用overlap pcr 将两个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。26.将表达载体pgap 用takara 公司的sal i 和ecor i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，sal i 1 μl，ecor i 1 μl，pgap 载体7 μl。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（mis1-f、gcv1-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpgap-mis1-p2a-gcv1并进行dna测序，验证重组质粒构建正确（图1（a））。27.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pgap-mis1-p2a-gcv1。取2 μl pgap-mis1-p2a-gcv1质粒电转化入已经敲除异化途径的毕赤酵母中。pcr 筛选阳性菌株gs115-mis1-p2a-gcv1。28.2、pgap-gcv2-p2a-gcv3重组质粒的构建以具有gvc2、gvc3基因的毕赤酵母基因组为模板，通过常规pcr扩增复制该基因的核苷酸编码序列。29.所用gvc2上游引物带有同源臂，序列为：gvc2-f:tatttcgaaacgaggaattgaaacgatgttaagaacccagttctccagvc2下游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：gvc 2-r：tctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggcttgactagca。30.所用gcv3上游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：gcv3-f：tgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacgagcv3下游引物带有同源臂，序列为：gcv3-r：atgatgatgatgatggtcgattagctttcctcctgcaaaaacttgac。31.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。32.将回收的片段作为模板加入上引物gcv2-f,下引物gcv3-r利用overlap pcr 将两个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。33.将表达载体pgap 用takara 公司的sal i 和ecor i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，sal i 1 μl，ecor i 1 μl，pgap 载体7 μl。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（gvc2-f、gvc3-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。菌落pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpgap‑ꢀgcv2-p2a-gcv3，验证重组质粒构建正确(图1（b）)。34.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pgap-gcv2-p2a-gcv3取2 μl pgap-gcv2-p2a-gcv质粒电转化入 pgap-gcv2-p2a-gcv3毕赤酵母中，pcr 筛选阳性菌株 gs115-mis1-p2a-gcv1-gcv21-p2a-gcv3，将获得的重组菌株命名为：gs115-δfdh-rgly3、pet28a-his重组质粒的构建以具有das基因上下同源臂的毕赤酵母基因组为模板，通过常规pcr扩增同源臂的核苷酸编码序列。35.所用上同源臂上游引物带有同源臂，序列为：s-f:gtggtggtggtggtgctcgagggtactctttgacatagctatcaactaactttttcc上同源臂下游引物带有同源臂，序列为：s-r：gaaactgggacttatttaaatggctagaattccaaaagcagtatcg。36.所用下同源臂上游带有同源臂，序列为：x-f:acggagctcgaattcggatccatggctagaattcccaaagcagttt下同源臂下游引物带有同源臂，序列为：x-r:ggtgccgcgcggcagccatatggatagttcttaacgtactcatccaaaagtttcttcc。37.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。38.以具有组氨酸筛选标签基因的ppic9k质粒作为模板，通过常规pcr扩增组氨酸筛选标签的核苷酸编码序列。39.所用组氨酸筛选标签基因上游引物带有同源臂，序列为：h-f: ttttggaattctagccatttaaataagtcccagtttctccatacgaacc组氨酸筛选标签基因下游引物带有同源臂，序列为：h-r:ccgaattcgagctccgtcgactcagaattggttaattggttgtaacactggc。40.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。41.将回收的片段作为模板加入上引物s-f,下引物x-r利用overlap pcr 将三个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。42.将表达载体pet28a 用takara 公司的nde i 和xho i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，nde i μl，xho i 1 μl，pet28a 载体7 μl。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（s-f、h-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpet28a-his并进行dna测序，验证重组质粒构建正确(图1（c）)。43.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pet28a-his 取2 μl pet28a-his质粒电转化入gs115-δfdh-rgly毕赤酵母中。pcr 筛选阳性菌株gs115-δfdh-rgly-δdas。44.相似的取2 μl pet28a-his质粒电转化入毕赤酵母gs115中。pcr 筛选阳性菌株gs115-δdas。45.4、pic9k-fld-p2a-fgh-pts1重组质粒的构建以具有fgh、fld基因的毕赤酵母基因组为模板，通过常规pcr扩增复制该基因的核苷酸编码序列。46.所用fgh上游引物带有同源臂，序列为：fgh-f:tatttcgaaacgaggaattgaaacgatgttaagaacccagttctccafgh下游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：fgh-r：cacgtctcctgcttgctttaacagagagaagttcgtggccaacttagagtttaaccccaaatactttgcatggtg。47.所用fld上游引物带有p2a序列作为同源臂，序列为：fld-f：tgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctgaaacgatgtctaccgaaggtcaagtaagttcaat。48.fld下游引物带有同源臂，序列为：fld-r：aaggcgaattaattcgcggccgcttacaacttagagtgcatagtaatcacagcac。49.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。50.将回收的片段作为模板加入上引物fgh-f,下引物fld-r利用overlap pcr 将两个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。51.将表达载体pic9k 用takara 公司的bamh i和not i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，bamh 1 μl，not i 1 μl，pic9k 载体7 μl。酶切体系于先于30℃条件反应1小时，再在37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（fgh-f、fld-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。菌落pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpic9k-fld-p2a-fgh-pts1，验证重组质粒构建正确(图1d)。52.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pic9k-fld-p2a-fgh-pts1。取2 μl pic9k-fld-p2a-fgh-pts1质粒电转化入gs115-δfdh-rgly-δdas毕赤酵母中，菌落pcr 筛选阳性菌株，将获得的重组菌株命名为：gs115-δfdh-rgly-δdas-fgh-fld-tps1。53.5、区室化表征菌株gs115-fgh-ptsi-gfp、gs115-fld-pts1-rfp构建以具有fgh、fld基因的毕赤酵母基因组为模板，通过常规pcr扩增复制该基因的核苷酸编码序列。54.所用fgh上游引物带有同源臂，序列为：fgh-f:aactaattattcgaaggatccatgtcatcaattactacttcaatcttcaaggtaacagfgh下游引物带有linker序列作为同源臂，序列为：fgh-r：caccgccagagccacctccgccgtttaaccccaaatactttgcatggtgag。55.所用gfp上游引物带有linker序列作为同源臂，序列为：gfp-f：ggtggctctggcggtggcggatcgatggtgagcaagggcgag。56.gfp下游引物带有pts1序列同源臂，序列为：gfp-r：aaggcgaattaattcgcggccgcttacaacttagacttgtacagctcgtccat。57.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。58.将回收的片段作为模板加入上引物fgh-f,下引物gfp-r利用overlap pcr 将两个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。59.将表达载体pic9k 用takara 公司的bamh i和not i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，bamh 1 μl，not i 1 μl，pic9k 载体7 μl。酶切体系于先于30℃条件反应1小时，再在37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（fgh2-f、gfp-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。菌落pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpic9kꢀ‑fgh-gfp-pts1，验证重组质粒构建正确。60.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pic9kꢀ‑fgh-gfp-pts1。取2 μl pic9kꢀ‑fgh-gfp-pts1质粒电转化入毕赤酵母中gs115，菌落pcr 筛选阳性菌株，将获得的重组菌株命名为：gs115‑ꢀfgh-gfp-pts1。61.所用fld上游引物带有同源臂，序列为：fld-f:ttattcgaaggatccgaaacgatgtctaccgaaggtcaagtaagttcaat。62.fld下游引物带有linker序列作为同源臂，序列为：fld2-r：caccgccagagccacctccgccgtgcatagtaatcacagcacgaatacag。63.所用rfp上游引物带有linker序列作为同源臂，序列为：rfp-f：ggtggctctggcggtggcggatcgatggtgcgctcctccaag。64.rfp下游引物带有pts1序列同源臂，序列为：rfp-r：agtttttgttctaggcggccgcttacaacttagacaggaacaggtggtg。65.反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。66.将回收的片段作为模板加入上引物fld-f,下引物rfp-r利用overlap pcr 将两个片段连接在一起。反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃ 5 min，得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。67.将表达载体pgapza 用takara 公司的bamh i和not i酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μl，bamh 1 μl，not i 1 μl，pic9k 载体7 μl。酶切体系于先于30℃条件反应1小时，再在37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20 bp序列作为同源臂，并将其分别添加到基因特异性上下游引物序列（fld-f、rfp-r）的5’端。重组反应体系为：使用vazyme 公司的5 x ce ii buffer 4 μl，exnase ii 2 μl，基因片段10 μl，载体2 μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。菌落pcr筛选阳性菌株trans1-t1‑ꢀpgapzaꢀ‑fld-rfp-pts1，验证重组质粒构建正确。68.将阳性菌株接种至5 ml lb/kanr 液体培养基，lb/kanr 液体培养基组成为蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、氯化钠5 g/l，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pgapzaꢀ‑fld-rfp-pts1。取2 μl pgapzaꢀ‑fld-rfp-pts1质粒电转化入毕赤酵母中gs115，菌落pcr 筛选阳性菌株，将获得的重组菌株命名为：gs115‑ꢀfld-rfp-pts1。69.实施例3 重组菌株的表型验证1、敲除菌株发酵验证验证敲除das基因之后对毕赤酵母同化影响，将毕赤酵母gs115、gs115-δdas菌株分别接种至5 ml ypd液体培养基，30℃、200 rpm 条件下振荡培养至od600≈5。将培养后的菌液均按初始od600=0.2离心重悬后分别接种于100ml新鲜的m9液体培养基并加入体积1%的甲醇，30℃、200 rpm 条件下振荡培养每隔24小时进行取样测其od600。从发酵验证结构来看敲除das基因之后的菌株是无法在甲醇作为唯一碳源的培养基生长（图2（a））。70.2、区室化定位重组菌株发酵表征验证信号肽pts1定位效果，将构建的表征菌株gs115-fgh-ptsi-gfp、gs115-fld-pts1-rfp分别接种至100 ml ypd液体培养基加入体积1%的甲醇进行诱导30℃、200 rpm 条件下振荡培养24小时后收集菌体，使用荧光显微镜分别在487nm、554nm激发波长下观察荧光表达。从荧光图片可以看到信号肽pts1能够将蛋白定位到过氧化酶体中（图2（b）、图2（c））。71.3、重组菌株发酵验证将重组菌株gs115-δfdh、原始毕赤酵母gs115、gs115-δfdh-rgly-δdas-fgh-fld-tps1分别接种至5 ml ypd液体培养基，30℃、200 rpm 条件下振荡培养至od600≈5。将培养后的菌液均按初始od600=0.2离心重悬后分别接种于100ml新鲜的m9液体培养基并加入体积1%的甲醇，30℃、200 rpm 条件下振荡培养每隔24小时进行取样测其od600。72.从生长曲线可以看出在毕赤酵母中重构还原性甘氨酸途径可以代替原来甲醇代谢途径使得敲除das基因菌株能够正常利用甲醇，并且区室化设计的重组菌株较原菌株的生长状况有一定提高（图2（d））。73.其中，m9培养基（g/l）：na2po4·7h2o 12.8、kh2po4 3.0、nacl 0.5、nh4cl 1、mgso4·7h2o 0.492、cacl2·6h2o 0.02191。74.ypd培养基（g/l）：蛋白胨2、酵母粉1、葡萄糖2。75.4、重组菌株发酵甲醇消耗及甲酸积累将重组菌株gs115-δfdh、原始毕赤酵母gs115、gs115-δfdh-rgly-δdas-fgh-fld-tps1分别接种至5 ml ypd液体培养基，30℃、200 rpm 条件下振荡培养至od600≈5。将培养后的菌液均按初始od600=0.2离心重悬后分别接种于100ml新鲜的m9液体培养基并加入体积1%的甲醇，30℃、200 rpm 条件下振荡培养每隔24小时进行取样，离心取上清通过hplc高效液相色谱进行监测发酵过程中甲醇的消耗及甲酸积累情况。从数据来看重组菌株和原始菌株甲醇消耗速率相同，但重组菌株有明显的甲酸的积累情况（图2（e）、图2（f））。说明经过改造后的菌株避免了甲酸异化生成co2，优选的将甲酸走重构还原性甘氨酸途径进入中心代谢。76.实施例4ꢀꢀ重组菌株的13c二氧化碳标记实验为进一步表明还原性甘氨酸途径的打通，将进行13c二氧化碳标记实验。将重组菌株将重组菌株gs115-δfdh、原始毕赤酵母gs115、gs115-δfdh-rgly-δdas-fgh-fld-tps1接种至5 ml ypd液体培养基，30℃、200 rpm 条件下过夜培养。然后将培养后的菌液按初始od600=0.2离心重悬后接种于10ml新鲜的m9液体培养基并加入体积1%的甲醇、20mm13c-nahco3，30℃、200 rpm 条件下培养144h左右进行气质检测。77.从图413c‑ꢀnahco3标定结果来看，co2可以通过重构的还原性甘氨酸途径被固定，也进一步表明该途径成功的打通(图4)。78.综上所述，本发明首次提出通过在毕赤酵母中人工构建还原性甘氨酸途径与异化途径区室化理论设计，提高了毕赤酵母同化甲醇及co2效率以，为未来利用毕赤酵母生产化合物奠定了基础，具有深远意义。79.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。