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PCR反应是分子生物学最基本的实验之一,影响PCR结果的主要因素之一就是引物设计。前两期小编给大家介绍的两款软件SnapGene和DNAMAN就都能够用于设计引物。但要说到最专业的引物设计软件,大家肯定首先想到Primer Premier 5,这里小编给大家带来的是这款软件的升级版Primer Premier 6。
01软件安装
介绍软件的安装之前先预警一波,Primer6的安装稍显复杂,请小伙伴们严格按照小编说的操作,否则可能会出现软件无法激活的情况。
01
安装Java控制台
由于软件的补丁是一个Java程序,安装软件之前需要在电脑中安装Java控制台。网址是
http://java.com/zh_CN/download/manual.jsp(可能需要翻一下才能进入),注意32/64位的要区分开来,可进入自己的电脑属性里边查看自己的电脑位数并下载对应的Java,下载好后安装,安装完成后最好重启下电脑。
如果大家的电脑是64位系统,并且恰好安装有360的话(真的不是打广告~),也可以直接在360软件管家中搜索Java,直接安装一个Java控制台。
图片来源:软件截图
02
安装Primer6
软件解压后会有三个文件,Primer6的安装包PP600Installer和激活补丁Patcher,还有一个说明文档crack。直接PP600Installer安装,需要注意的是,一定要将软件安装到以下路径C:\Program Files。尤其是64位系统,不要直接安装到Program Files(x86)。安装完成后先关闭软件。
图片来源:软件截图
03
安装补丁
将上述激活补丁Patcher文件复制到以下文件夹
C:\ProgramFiles\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600。大家可以在C盘【Program Files】文件夹下新建【http】文件夹,然后在【http】文件夹下再新建【Dwww.premierbiosoft.com】文件夹,以此类推,最后将Patcher文件复制进去即可。对cmd命令行熟悉的朋友也可以尝试用cmd命令行进行操作。(32位系统按照以下路径操作【C:\Program Files\Primer Premier 6.0\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600】)
最后重点来了,完成上述步骤后,以管理员身份运行cmd。方法是左下角搜索cmd,单击鼠标右键,选择以管理员身份运行。
图片来源:软件截图
打开cmd命令行后,先输入Java命令,若出现以下界面则说明电脑中已顺利安装Java。
图片来源:软件截图
然后继续在光标后面输入以下命令:
cdC:\ProgramFiles\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600,回车,之后在出来的界面后边输入java -jar patcher.jar,看到cmd中出现Done,说明软件就已经顺利激活了。(32位系统相应的命令改为cd C:\Program Files\Primer Premier6.0\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600)
图片来源:软件截图
02软件使用
01
软件界面
Primer6的界面相对于Primer5改动较大,主要包括主菜单,工具栏和序列栏三部分。
图片来源:软件截图
02
引物设计
单击菜单【File】→【New】→【Sequence】,将需要设计引物的序列粘贴进去,【Add】,即可导入序列。
图片来源:软件截图
工具栏中的引物设计按钮,设置好Tm值,引物长度,扩增产物长度等参数,有需要的话也可以在高级设置中选择更多其他参数。设置好后Search,即可生成引物。
图片来源:软件截图
引物生成后会出现引物的具体信息,包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息,并在序列窗口标出了具体的信物位置。All Primers,则会出现更多的引物序列,All structures则会显示引物可能形成的引物二聚体(Self Dimer)、发卡结构(Hairpin)、引物错配(Cross Dimer)、自由能(△G,自由能越小越稳定,因此△G越大引物效果越好)等信息。通常我们选择默认的引物即可。
图片来源:软件截图
03在线引物设计
鉴于Primer6的安装相对复杂,这里小编也介绍两个常用的引物设计网站,不想捣鼓上面一通操作的小伙伴也可以直接在线设计引物。
01
Primer 3
(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)
Primer3的操作与上述Primer6的操作基本一致,粘贴序列后,通常只需要选择引物长度即可生成引物。输出的结果中也含有引物序列、长度、Tm值等信息。
图片来源:软件截图
02
Primer-BLAST
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)
这是NCBI网站中的引物设计工具,操作与Primer3基本一致,小编之前也介绍过这个网站(NCBI网站的小彩蛋)。primer-BLAST最大的优势在于系统会将你扩增的片段在NCBI数据库中进行BLAST比对,为你筛选出最特异的引物。引物设计的结果同样有两个,引物位置示意图和详细的引物信息。这个小工具结合了primer3和BLAST的优势,尤其适用于设计qrt-PCR引物。
图片来源:软件截图
图片来源:软件截图
结 语
最后小结一下,Primer6相对于Primer5其实提升并不大,只是多了一个SNP分析的鸡肋功能,反而还去掉了酶切位点分析的功能。对于一般性的设计引物,用在线的Primer3或者Primer-BLAST就够了。也欢迎大家在我们的科研交流群中积极讨论。
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